Тема 5 Клеточная селекция и инженерия

План лекции:

1. Изменчивость культивируемых клеток и её использование в селекции.

2. Сомаклональная вариабельность.

3. Практическое использование сомаклональных вариантов.

4. Выделение протопластов.

5. Культивирование протопластов.

6. Методы слияния протопластов.

7. Соматическая гибридизация.

8. Генетические основы соматической гибридизации.

 

Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, в настоящее время находит все большее применение и при создании новых биотехнологий. Начиная с первых работ по культивированию растительных клеток, тканей и органов особый интерес у исследователей вызвал вопрос о том, какие клеточные изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах, и причины, их вызывающие. С разработкой техники получения растений-регенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений. Такое разнообразие среди клеточных линий и растений-регенерантов получило название «сомаклоны», хотя еще в 70 – 80 - е годы ХХ столетия было принято называть растения, регенерировавшие из каллусной ткани, «калликлонами», а из протопластов – «протоклонами».

Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены. Однако четко можно выделить зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде всего, от генетической гетерогенности соматических клеток исходного экспланта, генетической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования in vitro, а также от генотипа и исходного экспланта.

Дифференцированные клетки в нормальном растении могут иметь разную степень плоидности, но для отдельных видов характерно наличие только диплоидных клеток. Однако в процессе онтогенеза могут возникать клетки с разной плоидностью. Например, экспериментально доказано, что в меристемных тканях, наряду с фактором видового постоянства числа хромосом, почти у 80 % покрытосеменных растений в процессе дифференцировки в соматических клетках может происходить эндоредупликация хромосом и формирование тканей различного уровня плоидности. Для вегетативно размножаемых и апомиктичных растений характерно образование с высокой частотой анеуплоидных клеток. Усиление хромосомных перестроек, приводящих к появлению химерности и миксоплоидии у растений, наблюдается при изменении условий произрастания, особенно при их резком ухудшении: засоление почв, повышенные или пониженные температуры, применение гербицидов или пестицидов, минеральных удобрений в повышенных дозах и др. Эти и другие часто встречающиеся в практике факторы могут приводить к физиологическим нарушениям, связанным, в первую очередь, с появлением аномальных митозов и формированием клеток с числом хромосом, отличающимся от такового в материнской ткани.

Цитологические исследования показали, что вариабельность, индуцируемая условиями культивирования in vitro, связана с генетическими изменениями. Прежде всего одним из основных источников появления фенотипических вариантов являются различные кариологические изменения и перестройки. Однако выявить, какие из них будут иметь фенотипический эффект и наследоваться как стабильная мутация генов, часто сложно. Как грубые, так и тонкие хромосомные изменения – мелкие деления, дупликации, транслокации, инверсии – могут вызвать существенные фенотипические изменения как в растениях-регенерантах, так и в последующем потомстве. Хромосомные изменения часто наблюдаются при мейозе. Анализ мейоза клетки в регенерантах показал такие интенсивные перестройки хромосом, как транслокация, инверсия, субхроматидный обмен, частичная утрата хромосом. Это является доказательством того, что большая часть фенотипических изменений обусловлена генетическими механизмами.

Сомаклональную изменчивость можно проследить на молекулярном уровне, оценивая тонкие перестройки ядерной ДНК.

Кроме сомаклональной вариабельности, связанной с наследуемыми перестройками генома, отмечены фенотипические изменения («эпигенетические»), которые могут стабильно передаваться дочерним клеткам, но не проявляться в растениях-регенерантах или их половом потомстве.

Высокая степень разнообразия сомаклонов зависит от исходного генотипа, природы и стадии развития экспланта. Например, у различных злаков степень изменчивости среди сомаклонов может значительно различаться: у пшеницы (2 n =6х=42) из 192 исследованных растений-регенерантов 29 % были анеуплоидами, у гексаплоидного овса (2n =6х=42) выявлены цитогенетические изменения с такой же частотой, а для кукурузы частота возникновения анеуплоидных растений не превышала 2 – 3 %. Образование полиплоидных и анеуплоидных растений может наблюдаться и у других видов, например, на картофеле. Причем частота появления новых вариантов у диких видов значительно ниже, чем у диплоидных линий культивируемого картофеля.

Тип исходного экспланта также влияет на появление сомаклональных вариантов, отличающихся количественными и качественными признаками. Для картофеля, например, аномальные растения получены в 12 % случаев при использовании в качестве первичного экспланта мезофильных тканей листа, а в случае использования лепестков или оси соцветий частота формирования растений с фенотипическими отклонениями от нормы составила 50 %.

Условия культивирования и, в частности, нарушение гормонального баланса питательной среды – одна из причин возникновения генетического разнообразия культивируемых клеток вследствие нарушения клеточного цикла, в частности митоза. От соотношения фитогормонов, входящих в состав питательных сред, во многом зависит цитогенетическая структура клеточных популяций. Однако морфологическая и цитогенетическая разнокачественность клеточных популяций может возникнуть и вследствие влияния отдельных компонентов питательной среды: некоторых минеральных солей, сахарозы или другого источника углеродного питания, витаминов, растительных экстрактов, а также от режима выращивания. Длительное культивирование клеток in vitro также способствует повышению генетического разнообразия сомаклонов. Причем для некоторых видов показано, что, несмотря на присутствие в культуре клеток разной плоидности, регенерировавшие растения были преимущественно диплоидными. Это явление было объяснено тем, что в процессе культивирования отбирались растения-регенеранты с более или менее нормальной морфологией, которые регенерировали, как правило, в первую очередь.

Различные типы морфогенеза – соматический эмбриогенез или органогенез – также могут по-разному сказываться на генетических изменениях и, соответственно, на фенотипе растений. Экспериментально установлено, что при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла клетка – растение значительно короче, чем при органогенезе, поэтому степень сходства получаемого материала и исходного родительского генотипа может быть значительно выше.

Сомаклональные варианты имеют, несомненно, практическое применение в сельскохозяйственной практике, в силу появления форм, отличающихся от родительских по различным биохимическим, качественным и количественным признакам, а также цитогенетическим характеристикам. Например, получены сомаклоны картофеля сорта Зарево, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях протеина и крахмала. Причем наследование важных признаков при размножении клубнями сохранялось в течение трех лет полевых испытаний (В.В. Сидоров и др., 1984, 1985). В настоящее время метод культуры тканей начал широко использоваться в селекции не только кормовых и технических культур, но и декоративных и лекарственных растений. Примером тому может служить новый сорт пеларгонии Velvet Rose, полученный через каллусную культуру.

Таким образом, полученные положительные результаты свидетельствуют о необходимости более эффективного внедрения различных приемов получения сомаклональных вариантов в практику селекционной работы, и наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам.

Значительный интерес представляет вопрос об использовании клеточной селекции в комплексе с получением сомаклонов. Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для сельского хозяйства – возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками.

Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:

— прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток;

— непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;

— тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;

— визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.).

Из перечисленных выше приемов клеточной селекции прямая селекция является наиболее распространенным методом и используется главным образом для выделения растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам.

Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования.

Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта, медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.

Получение стабильно устойчивых линий – процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих 4 – 6 субкультивирований на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2 – 3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов – возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам.

Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне редко, на древесных. Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCl или Na₂SО₄.

Таким образом, использование каллусной культуры в селекционных целях открывает огромные возможности в создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества.

Наряду с перечисленными выше объектами (каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей. Например, путем культивирования и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным содержанием белка.

Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2 – 4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции.

Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:

· невысокая производительность,

· можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом,

· трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:

· одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн из грамма ткани или клеток),

· клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу,

· клетки не повреждаются,

· метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

1. Обработка ферментами,

2. Выделение протопластов из клеточных стенок,

3. Отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum:

Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60 - 80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помещают на 15 - 20 минут в 10% раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев.

Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl₂, KCl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15^о. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования.

Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28^оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк).

Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования.

В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45^оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28^оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора:

· видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения,

· способ и условия выделения протопластов,

· плотность высева протопластов,

· состав питательной среды.

Протопласты являются уникальной моделью для изучения фундаментальных физиологических проблем у растений. Они незаменимы при изучении состава, структуры и функционирования плазмалеммы в норме и при воздействии на нее гормонами, ингибиторами, фитототоксинами, а также при взаимодействии самих протопластов в популяции. Кроме того, протопласты могут использоваться для определения состава и архитектоники первичной клеточной стенки и изучения механизма ее репарации после разрушения.

Изолированные протопласты имеют ряд областей применения как теоретического, так и прикладного характера:

1. Изучение химии и структуры клеточной стенки (и при разрушении, и при синтезе «de novo»).

2. Изучение свойств плазмалеммы, трансмембранных перемещений.

3. «Мягкое» выделение органелл.

4. Наблюдение за закономерностями дифференцировки клеток при слиянии протопластов, отслеживание взаимодействия ядра и цитоплазмы в полученной гибридной клетке, изучение соматических гибридов.

5. Введение чужих органелл.

6. Введение чужеродных генов в растительную клетку (трансгенез).

Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

· Скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов),

· Получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого,

· Слияние трех и более клеток,

· Получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей,

· Перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение,

· Получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков - скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д. Наличие косегрегация генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов.

Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.

При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году, протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах образуются агрегаты из 2 - 3 протопластов, либо цепочки из 5 - 6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов.

В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт.

Чаще для индукции слияния протопластов используют методику "ПЭГ - высокие значения рН - высокая концентрация Са²⁺", которая дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 - 11, концентрация Са²⁺ 100 - 300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция - их слияние. Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой.

При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния - АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флюоресценции - желто-зеленый и красный.

Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 году (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Бутенко Р.Г. в 1975 году.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной:

1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений.

2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.

3. Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток.

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид - продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цито­плаз­матический гибрид) - растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках (Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник, 1984).

При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.

Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения – регенеранты.

Впервые зрелый межвидовой гибрид, полученный в результате парасексуальной гибридизации протопластов 2 сортов табака (Nicotiana glauca, c 24 хромосомами и N.langsdorfii c 18 хромосомами), описан Карлсоном в 1972 г. Каллус амфиплоидного гибрида мог расти на безгормональной среде. Гибридное растение цвело. С тех пор были получены жизнеспособные внутривидовые, межвидовые, межродовые гибриды.

Осуществлено слияние протопластов культурного картофеля сорта Приекульский ранний (Solanum tuberosum) с протопластами дикого картофеля (S. chacoense). Известно, что у дикого картофеля клубни очень мелкие. Вместе с тем, растение устойчиво ко многим заболеваниям. Картофель сорта Приекульский ранний образует крупные клубни, но растения этого сорта восприимчивы к болезням. Размеры протопластов у этих растений разные. Соматические гибриды по форме листьев и кустов, размеру клубней занимали промежуточное положение между культурными и дикими растениями. Вместе с тем гибрид, полученный в результате соматической гибридизации, оказался устойчивым к вирусу «У», чем отличался от полового гибрида.

Первая попытка по созданию межродовых гибридов принадлежит Г. Мельхерсу, создавшему в 1978 году гибрид картофель + томат, так называемый томатофель. Гибрид был стерилен, морфологически аномален: толстые корни, отсутствие типичных столонов, махровые цветки. Было еще несколько попыток получения таких гибридов, но все растения стерильны. Эти эксперименты показали ограниченность применения парасексуальной гибридизации для прикладной селекции. Японскими исследователями (Х. Кисака с соавт., 1997) путем электрослияния протопластов ячменя и риса был получен межродовой соматический гибрид. Протопласты риса получали из суспензионной культуры, а протопласты ячменя были изолированы из молодых листьев. Часть полученных каллусов сформировали зеленые участки и побеги. Только один побег сформировал корни, и это растение было успешно перенесено в почву. По морфологии было близко к растениям риса. Цитологический анализ показал, что растение имело и маленькие хромосомы от риса, и большие от ячменя. Были проанализированы также митохондриальная и хлоропластная ДНК. Растение содержало новые последовательности и в митохондриальной, и в хлоропластной ДНК, которые не обнаруживались ни в одном из родителей.

Была осуществлена гибридизация 2-х родов пасленовых Datura innoxia + Atropa belladonna. Удалось регенерировать растения. Во всех случаях выявлены хромосомы обоих родительских видов. Амфиплоиды оказались неспособны к стеблевому морфогенезу, в линиях с полиплоидным и анеуплоидным наборами хромосом получали аномальные стебли. Регенерировавшие растения были стерильны, похожи на дурман, но содержали небольшое количество хромосом красавки.

В других экспериментах сливали протопласты красавки с каллусными клетками китайского табака. Получили 12 клонов. В клетках всех клонов обнаружили хромосомные типы обоих родителей, через год только у двух клонов происходила полная элиминация хромосом красавки.

Интересные эксперименты были проведены в этой же лаборатории по гибридизации хлорофиллдефектного табака с красавкой. После слияния получили 40 фотосинтезирующих колоний, из них 4 клеточных линии дали нормальные растения красавки, 4 - аномальные по морфологии гибриды табак + красавка, остальные - зеленые, иногда пестролистные растения, идентичные табаку, которые цвели, давали семена. Они содержали хромосомы табака и пластиды красавки. Это были первые фертильные межтрибные гибриды.

Первые работы по получению межсемейственных гибридов проведены К.Као и В.Веттером в 1976-77 гг. (соя + табак). Позднее в лаборатории Ю.Ю.Глебы провели аналогичные эксперименты пасленовые + бобовые и лилейные (горошек + табак и лук + табак). И.Ф.Каневскому удалось индуцировать морфогенез стеблеподобных тератом в культуре межсемейственных гибридов N.tabacum + Vicia faba.

Практически во всех случаях наблюдалась видоспецифичная элиминация хромосом одного из родителей. В культурах межсемейственных гибридов наблюдалось много многоядерных клеток, клеток с мини ядрами, в метафазах делений встречались гигантские хромосомы. Отмечена асинхронность в расхождении родительских хромосом в анафазе. Морфогенез у такого материала отмечен не был.

Для отдаленных гибридов характерно:

1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.

2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом).

3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.

4. Ограниченная морфогенетическая способность.

Изучение межцарственных гибридов клеток "животное + растение" показало, что на этапе слияния видоспецифичность не проявляется, поэтому можно слить даже животную и растительную клетки. На более поздних этапах онтогенеза эти различия сказываются, что было установлено в экспериментах по слиянию протопластов арабидопсиса и табака с лимфоцитами человека. При этом происходило слияние цитоплазмы, ядра не сливались. Эдвард Коккинг параллельно проводил изучение ультраструктуры таких гибридов, работая с клетками амфибий и протопластами моркови. После объединения клеток ядра амфибии были окружены тонким слоем собственной цитоплазмы, но уже через 48 часов отмечалось полное смешивание цитоплазмы и регенерация клеточной стенки вокруг гетерокариона.

Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Протопласты широко используются также в качестве реципиентов для клеточных органелл. В 1973 году И. Потрикусс и Ф. Хоффман успешно трансплантировали изолированные ядра петуньи в протопласты табака. Каким образом можно ввести ядро или другие клеточные органеллы в протопласт?

При использовании сэндвич-метода трансплантацию проводят в условиях слабого деплазмолиза протопласта. Перед введением протопласты и ядра обрабатывают лизоцимом, который модифицирует клеточную мембрану. Далее осуществляют попеременное осаждение ядер и протопластов центрифугированием. В результате центрифугирования в пробирках формируется несколько чередующихся слоев. Центрифужные пробирки заполняют раствором осмотика (маннита) без лизоцима и центрифугируют полчаса при 140 g, оставляют на 2 часа при температуре +4^оС. Осадок ресуспендируют и просматривают под микроскопом. Ядра можно обнаружить и в цитоплазме, и в вакуолях. В некоторых случаях при поглощении ядра образуются жизнеспособные гибриды, в других - в клеточном цикле происходит потеря интеграции между чужеродным ядром и ядром хозяина.

Клеточные органеллы можно также переносить посредством липосом. Широкий спектр одно- и многоламелльных частиц, которые сливаются с мембранами протопластов, получен с применением таких веществ, как фосфатидилсерин, холистерол и т.д. Можно также переносить органеллы путем микроинъекций. Этот метод широко используется для введения в клетку ДНК, РНК, а недавно был успешно использован и для переноса клеточных органелл у растений.

Кроме ядра трансплантируют и другие органеллы, такие как митохондрии и хлоропласты. Выбор этих органелл объясняется их полуавтономностью, то есть наличием собственной ДНК и способность делиться самостоятельно, независимо от деления самой клетки. Кроме того, эти органеллы контролируют важнейшие физиологические процессы растительной клетки, такие как фотосинтез и дыхание. Например, перенос хлоропластов может использоваться для выведения новых форм хозяйственно важных сортов растений. Трансплантация высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растения.

Одним из важных моментов является сохранение клеточных органелл, поэтому для переноса их в последнее время используются субпротопласты – фрагменты, полученные из протопластов. Они могут содержать большую часть цитоплазмы, но без ядра (цитопласты), ядро с небольшим количеством цитоплазмы (кариопласты), часть хромосом с небольшим количеством цитоплазматического материала (микропротопласты).

Биологическое конструирование на уровне клетки может оказаться полезным и перспективным для создания клеток, клеточных систем и целых растений, удовлетворяющих потребности человека. Под биологическим конструированием следует понимать не только введение отдельных органелл. Аналогичным образом в клетку можно вводить и чужеродный генетический материал как в виде фрагментов ДНК, так и в виде отдельных хромосом. Кроме того, в изолированные протопласты можно вводить клетки микроорганизмов, создавая, таким образом, искусственные ассоциации.

В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.

Изменяя условия (добавляя в состав питательной среды те или иные гормоны), можно вызвать дифференциацию недетерминированных клеток. Культура растительной ткани позволяет получить многочисленные популяции в сравнительно короткое время и в ограниченном пространстве. Клетки в условиях in vitro лишаются очень многих важных взаимодействий, которые определяют их судьбу и дифференциацию в целом организме. В определенных пределах дифференциация культивируемых клеток поддается контролю со стороны экспериментатора.

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная ткань - один из видов клеточной дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа.

Образование каллуса не всегда связано с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза из-за нарушения гормонального баланса. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений - корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (экспланты) помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, колбы, чашки Петри (in vitro).

В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-масляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг / л, в зависимости от вида экспланта.

Процессу образования каллуса предшествует дедифференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток. Если эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа, то имеет в своем составе эпидермальные клетки, клетки камбия, сосудистой системы, сердцевинной и первичной коровой паренхимы. Преимущественно пролиферируют клетки камбия, коры, сердцевинной паренхимы.

Различное тканевое происхождение каллусных клеток является одной из причин гетерогенности каллусной ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации. В качестве примера можно привести процессы, происходящие при дедифференцировке апикальной меристемы стебля. После помещения на питательную среду меристемы стебля томатов отмечено прекращение митоза, клетки увеличиваются в размерах, теряют характерную для меристематической ткани форму, изменяется структура ядра и цитоплазмы. В готовящейся к делению клетке возрастает синтез всех форм РНК, исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменениях в активности генов и белкового аппарата клетки при дедифференцировке.

Активаторами матричной активности ДНК хроматина или активности РНК–полимеразы являются фитогормоны. Рецепторные для фитогормонов белки, локализованные в мембранах, по-видимому, оказывают влияние в присутствии фитогормонов на структуру и функцию мембран. Возможно, это обусловливает действие фитогормонов на генную активность.

Одним из важнейших гормонов, применяемых при культивировании in vitro является ауксин, который активирует деление и растяжение клеток. Проникая в клетки, ИУК связывается со специфическими рецепторами, оказывая влияние на функциональную активность мембран, полирибосом и работу ядерного аппарата. Установлено, что в плазмалемме ауксин индуцирует работу Н⁺-помпы, в результате чего матрикс клеточных стенок размягчается, что является необходимым условием для роста и растяжения клеток. Включенная Н⁺-помпа усиливает поглотительную активность тканей, обогащенных ауксином. Предполагается, что поступление ауксина в клетку способствует усилению секреции кислых гидролаз и полисахаридов, необходимых для дальнейшего роста клеточных стенок. Под влиянием ауксина уменьшается продолжительность различных периодов митотического цикла. Так, предполагается, что уменьшается продолжительность периода удвоения числа клеток, продолжительность S - периода, G₁ - периода. Все это приводит к значительному ускорению темпов размножения клеток.

Общим моментом в действий, ауксинов на деление клеток является также предварительное усиление синтеза и накопление РНК. Стимулирующее действие ауксинов на синтез РНК может быть связано с восстановлением клеток после голодания перед их вхождением в митотический цикл, но может быть также приурочено к прохождению клетками этапов митотического цикла. Особенно отчетливо необходимость синтеза РНК проявляется при прохождении клетками G1 - периода. Под влиянием ауксина усиливается синтез р-РНК, но имеет место и появление новых информационных РНК, причем на очень ранних этапах действия.

Осуществление клетками подготовки к делению на всех этапах митотического цикла зависит от синтеза белков. Ауксин вызывает как общую стимуляцию их синтеза, так и появление новых белков. Это позволяет предположить существование в хроматине структурных генов, транскрипция которых специфически индуцируется ауксином. Реализация действия ауксина на хроматин и последующее деление осуществляется вследствие его проникновения в цитоплазму, образования комплекса с цитоплазматическим ауксиновым рецептором и воздействием этого комплекса на транскрипционную активность хроматина. Кроме этого, ауксин усиливает окислительную и фосфорилирующую активность митохондрий, в результате чего улучшается энергетическое и субстратное обеспечение процессов синтеза РНК и белков, репликация ДНК, а также осуществление самого митоза. Этот эффект обнаруживается очень рано и, как и синтез РНК, зависит от проникновения ауксина в клетку.

Для возбуждения процессов подготовки к делению достаточно начального кратковременного действия ауксина. Поэтому процессы, происходящие в клетках под влиянием ауксина, можно разделить на первичные, непосредственно индуцированные ауксином, и вторичные, являющиеся следствием первичного индуцирующего действия. Исходя из этого, можно предположить, что в митотическом цикле растительных клеток имеются кратковременные переходы, когда необходимо присутствие ауксина в клетках, и более продолжительные периоды, когда присутствие ауксинов в клетке не является необходимым.