Тема 9 Генетическая трансформация

План лекции

1. Генетическая трансформация на уровне отдельных клеток и на организменном уровне.

2. Маркеры и селективные системы, используемые для выделения клонов генетически трансформированных клеток.

3. Методы получения трансгенных животных.

 

В соответствии с целями и задачами экспериментальной работы можно выделить два направления культивирования животных клеток:

- культуры клеток;

- культуры органов и тканей (органные культуры).

Культуры клеток лишены структурной организации, теряют характерную гистиотипическую архитектуру и связанные с ней биохимические признаки и обычно не достигают равновесного состояния при отсутствии специальных условий. Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток, затем их идентифицируют (по фенотипическим признакам, путем выращивания в селективной среде, генотипически), разделяют на идентичные параллели и, если это необходимо, сохраняют. Динамические свойства культивируемых клеток часто трудно контролировать, также трудно реконструировать in vitro некоторые клеточные взаимодействия, наблюдаемые in vivo. В связи с этим некоторые исследователи предпочитают использовать клеточные системы, сохраняющие структурную целостность исходной ткани.

Список типов клеток, которые уже введены в культуру, достаточно велик. Это элементы соединительной ткани человека (фибробласты), скелетные ткани (кость и хрящи), скелетные, сердечные и гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие, почки и др.), клетки нервной системы, эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и различные опухолевые клетки.

Популяция клеток не всегда гомогенна и обладает фиксированным фенотипом. Некоторые культуры, например, кератиноциты эпидермиса, содержат стволовые клетки, клетки-предшественники и кератинизированные чешуйчатые клетки. В такой культуре происходит постоянное обновление за счет стволовых клеток, пролиферация и созревание клеток-предшественников, а также необратимая дифференцировка, сопровождающаяся "слущиванием" чешуйчатых клеток в культуральную среду.

Какую ткань лучше брать для введения в культуру, взрослую или эмбриональную, нормальную или опухолевую? Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими зрелыми тканями. Причиной этого служит низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клеток-предшественников в эмбрионах. Пролиферативная способность взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся специализированных клеток. Получение первичных культур клеток взрослых тканей и их размножение является более сложной задачей, продолжительность жизни таких культур, как правило, невелика. Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем жизни, тогда как культуры, полученные из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время. Дифференцировка нормальных клеток в культуре сопровождается обычно полным прекращением пролиферации клеток. В культурах опухолевых клеток возможна частичная дифференцировка при сохранении способности к пролиферации.

Свежевыделенные культуры носят название первичных культур до начала пассирования или субкультивирования. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются низкой пролиферацией. В них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены. Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. При этом получаются более однородные популяции, а также теряются специализированные клетки. После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Свойством "бессмертности" обладают в основном клетки, полученные из опухолей. Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно/цитоплазматического отношения, по увеличению скорости роста (время удвоения клеток в культуре снижается с 36 - 48 до 12 - 36 часов), по снижению зависимости от сыворотки, по увеличению эффективности клонирования, по снижению зависимости от субстрата, по увеличению гетероплоидности (хромосомные различия между клетками) и анеуплоидности и по увеличению опухолеродности. Нормальные клетки могут трансформироваться в постоянную линию, не становясь при этом злокачественными.

Органная культура - культивирование in vitro органа или части органа, в которых сохраняются анатомическая связь и функционирование тканей, максимально приближенные к таковым в условиях in vivo, то есть в организме. Миграция изолированных клеток на периферии экспланта подавляется специальными условиями культивирования, в результате чего могут даже образовываться дифференцированные структуры. Например, на периферии эксплантов легочной ткани развиваются новые мелкие бронхи, состоящие из альвеол, окаймленных бронхиальным эпителием.

Органная культура сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение долгого периода поддерживает гистологическую и гистохимическую дифференцировку, как правило, остается в не растущем состоянии в течение нескольких дней и даже недель. Эти культуры не способны к размножению.

Ткани, зависимые от гормонов, сохраняют чувствительность к ним и характерные ответы, эндокринные органы продолжают секрецию специфических гормонов и т.д. Наибольшее сходство процессов морфогенеза in vivo и in vitro отмечено для эмбриональных тканей.

Популярные ген-маркеры, используемые при трансформации клеток животных:

· ген тимидинкиназы;

· ген устойчивости к неомицину;

· ген устойчивости к этиловому спирту.

Так, маркеры, ответственные за запасные пути биосинтеза нуклеотидов, применяемые при трансформации животных клеток:

· тимидинкиназы;

· гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза;

· дегидрофолатредуктаза.

Выбор маркера и способа его «привязки» к антигену является одним из важных этапов в проведении анализа. Первоначально широко применялись радиоизотонные метки (радиоиммунный анализ - РИА), предложенные американскими исследователями (С. А. Берсон, Р. С. Ялоу, 1959). Однако в последние годы все более широкое использование в качестве маркеров находят ферменты. Это обусловлено рядом принципиальных трудностей, связанных с применением изотопныx маркеров. Так, изотоп ¹²⁵I имеет время полураспада 60 суток, чем ограничивается срок его использования. Изотоп ³Н имеет длительное время жизни (12.5 лет), однако под действием бэта-излучения происходит распад молекул антигена, в результате чего время жизни меченых ³Н-соединений тоже ограничено. Ограничивающими факторами РИА являются сложность и высокая стоимость оборудования, необходимость централизованной системы распределения иммунохимических наборов, меченных радиоактивными изотопами, определенная опасность изотопов для окружающей среды. Учитывая трудности использования радиоизотопных меток, были предложены в качестве маркеров ферменты. При иммуноферментном анализе антиген связывается с поверхностью лунки полистирольного планшета. В лунку добавляют антитела, несущие фермент в качестве метки, инкубируют и отмывают. Далее приливают субстрат, который меняет окраску при взаимодействии с этим ферментом. Изменение окраски можно измерить с помощью спектрофотометрии. Таким способом проводится индикация и количественная оценка биоорганических соединений с чувствительностью до 10-12 г/литр.

В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые находят применение в иммуноферментном анализе. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года. Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным. Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты.

Для введения ферментативной метки разработано много разных химических, биохимических и иммунологических способов.

Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкоамилазой. В настоящее время широко используются иммунопероксидазные конъюгаты и конъюгаты с бэта-галактозидазой. Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое распространение, однако к некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки.

Один из подходов получил название метода «гибридных антител». Ферментативным гидролизом получают Fab-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанодом; при этом Fab-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело-фермент. Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клетки, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколения, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями

Другой путь заключается в том, что получают антитела одного и того же вида животного (например, кролика) против определяемого антигена и фермента, которые соединяют между собой через антитела другого вида животных (антитела барана против кролика). Добавление фермента к такой тройной молекуле также приводит к образованию комплекса антитело-фермент. В настоящее время разрабатываются подходы получения гибридных антител методами клеточной и генной инженерии, что позволит существенно упростить способ их получения.

Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении — важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако высокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет.

Кроме ферментов в качестве маркеров могут быть использованы субстраты. Были использованы субстраты пероксидазы (люминол, изолюминол), которые могут быть окислены пероксидом водорода в реакции хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой.

Мечтой многих исследований-селекционеров мира является разработка возможности не просто отбора животных с измененной хозяйственно-полезной изменчивостью, а преднамеренное изменение генотипа и направленное создание желаемого типа животных. Это оставалось неосуществимой мечтой до тех пор, пока не были сделаны выдающиеся открытия — выявление ДНК как носителя генетической информации, пока не были заложены осно­вы рекомбинантной техники (открытие рестрикционных энзим, клонирования ДНК и т. д.) или генной инженерии. В относи­тельно короткие сроки были разработаны методы выделения из генома отдельных генов, создания эффективно функционируемых генных конструкций. В последующие годы были разработаны методы введения чужеродных генов в геном животных-ре­ципиентов. Селекционеры получили в свое распоряжение могучий инструмент для создания животных с совершенно новыми свойствами.

Что касается областей применения переноса генов у сель­скохозяйственных животных, то надежды ученых в настоящее время связаны с улучшением продуктивности и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням и создания так называемых «генных форм» или трансгенных животных-биореакторов ценных биологически активных веществ.

Трансгенные животные с основными хозяйственно полезными свойствами. Одним из основных направлений генной инженерии на первом этапе было направленное изменение наследственности животных в отноше­нии увеличения скорости роста, повышения надоев и улучше­ния качества продукции.

Рост животного является чрезвычайно сложным процессом, который зависит от действия генов, условий питания и факторов окружающей среды. С генетической точки зрения особенно интересны гены, кодирующие протеины каскада гормона роста, а именно, непосредственно гормон роста (ГР), рилизинг фактора гормона роста (Р) и инсулинподобный фактор гормона рос­та (ИФ ГР).

Еще в 1940-е годы было установлено стимулирующее действие гипофизарного ГР на молочную продуктивность коров. Однако, ввиду высокой стоимости препаратов гипофизарного ГР и невозможности его получения из гипофизов животных в больших количествах, они не нашли практического применения.

К концу 70-х годов, с началом эры генной инженерии и появлением дешевых гормональных препаратов, полученных путем микробиального синтеза на основе технологии рекомбинантной ДНК, был синтезирован ГР. Было показано, что ГР микробного происхождения оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР.

При крупномасштабном применении рекомбинантного ГР в дозе 13 мг в день увеличение удоев составляет 23—31 %. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие проводить обработку один раз в две недели и даже в месяц.

Ежедневные инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, вызывает увеличение суточных привесов нг 20—30% и сопровождаются сокращением расхода кормов нг единицу прироста. У молодняка свиней ускорение роста сопровождается увеличением содержания белка и уменьшением содержания жира в тканях, что повышает ценность мясопродукции.

Первые трансгенные мыши с геном ГР были получены в 1982 г. У них была установлена повышенная скорость ростг (четырехкратная) и удвоенная конечная живая масса.

В противоположность результатам, полученным на мышах, у трансгенных свиней с геном ГР у Пурсела и др. (1988, 1989) не наблюдалось соответствующего ускорения роста.

По сообщению Л.К Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7% выше, чем у контрольных животных.

Известно, что для ускорения роста свиней при инъекции ГР необходимо скармливать животным корма с повышенным содержанием протеина (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина. У потомства трансгенных свиней, получавших соответствующий модифицированный кормовой рацион, наблюдались на 16,5% более высокие среднесуточные привесы (Г. Брем и др., 1991).

Вместе с тем, все авторы единодушно отмечают, что трансгенные свиньи имеют более чем двукратное уменьшение толщины шпика (18—20 мм у контрольных свиней против 7—8 мм > трансгенных).

Разницу по скорости роста между трансгенными мышами и трансгенными сельскохозяйственными животными некоторые исследователи объясняют следующим образом. В используемых для переноса генов линий мышей не велась селекция по их ростовой продуктивности, тогда как большинство исследуемых свиней происходили из популяций, в которых в течение десятилетий велась селекция по этому показателю.

Селекция животных по резистентности к заболеваниям. Резистентность — это наследственная генетически обусловленная восприимчивость животных к определенным микроорганизмам, вирусам, паразитам или токсинам.

К сожалению, попытки вести селекцию на устойчивость к разным заболеваниям не дали радикальных результатов, хотя известны отдельные положительные примеры. Созданы, в частности, популяции крупного рогатого скота с примесью крови зебу, которые устойчивы к ряду кровепаразиторных заболеваний. Резистентность к ряду заболеваний является по­лигенным признаком, как, например, трипанотолерантность определенных африканских пород крупного рогатого скота, которые, кроме резистентности к заболеваниям, отличаются хорошей жаровыносливостью и нетребовательностью к условиям содержания и кормления. Вместе с тем, имеются механизмы резистентности, которые основываются на единичных генах, как, например, резистентность к диарее у новорожденных поросят, обусловленная Е. coli К88, или резистентность к гриппу у мышей.

Это послужило основанием для получения трансгенных животных с чужеродными генами, которые, возможно, обеспечат невосприимчивость таких животных к отдельным заболеваниям.

Защитные механизмы от инфекционных заболеваний функ­ционируют или путем препятствия вторжению возбудителя, или путем изменения рецепторов. Вторжению или размножению возбудителей препятствуют, главным образом, иммунные механизмы и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости, а также иммунологические способности различных молекул, таких, как интерферон, нейропептиды, гормоны и ин-терлейкины.

Одним из примеров гена резистентности является ген Мх мыши. Этот ген, найденный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх⁺-мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Этот ген был выделен, клонирован и использован, в частности, для получения трансгенных свиней, которые экспрессировали ген Мх на уровне РНК. Однако пока не получено данных об экспрессии у трансгенных свиней Мх-протеина и доказательства резистентности трансгенных свиней к вирусу гриппа.

Большой интерес представляют исследования по получению трансгенных животных с генами антисмысловой РНК. Экспрессия антисмысловой РНК в клетках приводит к последующей гибридизаци со смысловой РНК и, следовательно, к ингибированию репликации вирусального генома.

В экспериментах ученые продемонстрировали устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК против лейкоза крупного рогатого скота на организменном уровне к заражению вирусом лейкоза. У трансгенных кроликов с геном антисмысловой РНК против лейкоза крупного рогатого скота, зараженных антигеном р24, уровень антител был значительно ниже и не превышал титр 1:500 по сравнению с контрольными, у которых он изменялся в пределах 1:6000—1:8000.

Показана возможность создания внутриклеточной иммунизации против инфекционных вирусов. Эндогенные вирусные белки, в особенности их мутационные формы, могут служить защитой от соответствующих вирусов. В частности, получены трансгенные куры, устойчивые к вирусу лейкоза, у которых в клетках экспрессировался белок вирусной оболочки.

Приведенные выше данные открывают реальные перспективы повышения резистентности трансгенных животных к заболеваниям.

Заключение

Содержание учебного пособия соответствует требованиям к обязательному минимуму содержания основной образовательной программы по дисциплине «Сельскохозяйственная биотехнология» по направлению подготовки студентов специальности 5В070100 «Биотехнология».

В учебном пособие для студентов специальности 5В070100 «Биотехнология» отведено незначительное количество лекционного материала по дисциплине «Сельскохозяйственная биотехнология.

В построении учебного пособия предусматривается исходный уровень знаний студентов по данному предмету.

Учебное пособие знакомит с студентов с культурой клеткой растений, микроклональным размножением, прогамной и постгамной несовместимостью, клеточной селекций, клеточной инженерии, клонирование животных генетической трансформаций, криосохранением.

В представленном пособии приведены подробные сведения о сельскохозяйственной биотехнологии.

Данное пособие готовит студентов по специальности 5В070100 «Биотехнология» к самостоятельной работе.