2014-02-02
592
Типы и механизмы репарации.
Ферменты репарации
Эндонуклеазы – расщепляют связи внутри ДНК.
Экзонуклеазы – расщепляют связи с концов, могут быть специфичными для 5‘ и 3‘ концов ДНК.
ДНК-полимеразы – заполняют брешь, используя комплементарнуюцепь в виде матрицы.
Лигаза – катализирует образование фосфорнодиэфирных связей, используя энергию гидролиза АТФ.
ДНК-гликозилаза – расщепляет N-гликозидную связь.
АР-эндонуклеза – разрезает ДНК в апуриновых или апиримидиновых участках с образованием 5‘ конца
Прямая репарация ДНК
Прямое восстановление исходной структуры ДНК или удаление повреждения (структура поврежденного нуклеотида восстанавливается без его вырезания)
n Фотореактивация пиримидиновых димеров;
n репарацию ДНК за счет 3’-5’-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы;
n репарацию одноцепочечных разрывов ДНК с помощью полинуклеотидлигазы;
n генетическую репарацию повреждений, вызванных алкильными или метильными группами, путем удаления этих групп специфическими ферментами. Метилтрансферазнаяактивность(гликозилаз удаляют метильные группы)
|
|
|
Эксцизионная репарация
Репарация с удалением поврежденных
оснований
- удаление одного нуклеотида
- удаление фрагмента ДНК
мисмэтч репарация
- исправление неверных спариваний, аномальных гетеродуплексов и палиндромов.
n
Индуцируемая репарация
SOS-репарация
Рекомбинативная репарация
При помощи специфических реагентов проводится ограниченное расщепление определенных меченых нуклеотидов только по одному концу фрагмента ДНК. Ограниченная модификация определенных нуклеотидов проводится под действием различных химических агентов. Концентрация агента и продолжительность его воздействия на молекулы ДНК подбирается с расчетом, чтобы в каждой молекуле произошла модификация только одного нуклеотида, а поскольку в реакционной смеси присутствует огромное количество таких молекул, то, согласно теории вероятности, все основания данного типа в секвенируемом фрагменте ДНК окажутся модифицированными.
В результате четырех (или иногда трех, пяти или даже шести) типов реакций образуется смесь олигонуклеотидных молекул, которые различаются по размеру на один нуклеотид и несут на одном из концов метку, обычно радиоактивную. Разделение продуктов деградации проводят с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, способного разделять фрагменты ДНК, различающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид в широком диапазоне. Определить нуклеотидную последовательность секвенированного участка ДНК позволяет последующая радиоавтография геля. На рентгеновской пленке будет видна лестница из полос ДНК.
