Плесневые грибы

Микроорганизмы - продуценты ферментов

Тема 1.2. Оборудование для производства ферментных препаратов.

Получение микробных ферментных препаратов для спиртовой промышленности возможно благодаря разнообразным микроорганизмам. В зависимости от состава питательной среды и условий культивирования микроорганизмы легко переключаются с синтеза одного фермента на другой. У микроорганизмов сравнительно короткий цикл разви­тия (10—100 часов), что позволяет получать сотни урожаев в год.

Продуцентами ферментов могут быть бактерии, грибы, дрожжи и актиномицеты. Для промышленного получения ферментных препаратов используются как природные штаммы микроорганизмов, выделенные из естественных сред, так и мутантные, селекционированные воздействием на природные физических и химических мутагенов.

Микроорганизмы синтезируют одновременно комплекс ферментов, но некоторые из них, особенно мутантные штаммы, продуциру­ют в значительных количествах лишь один фермент. Для лучшего использования крахмалсодержащего сырья в спиртовом производ­стве осахаривающие материалы должны содержать не только амилолитические ферменты, но и ферменты, гидролизующие другие углеводы сырья — целлюлозу и гемицеллюлозы. Для обеспечения дрожжей азотистым питанием имеют значение и протеолитические ферментные препараты.

Несмотря на то, что для успешного осахаривания нужен комплекс ферментов, отбор микроорганизмов-продуцентов до сих пор проводился главным образом по высокой активности амилолитических ферментов — a-амилазы, глюкоамилазы и в более ранних работах — олиго-1,6-глюкозидазы (декстриназы).

Наиболее часто в качестве продуцентов амилолитических ферментов в спиртовом производстве используются плесневые грибы, реже — дрожжеподобные организмы и споровые бактерии.

Для получения амилаз широко применяют плесневые грибы рода Aspergillius, видов niger, orizae, usamii awamori, batatae; рода Rhizopus, видов delemar, tonkinensis, niveus, japonicum и др., а также отдельные представители Neurospora crassa и Mucor.

Плесневые грибы очень широко распространены в природе; основное место их обитания — почва. Несмотря на наличие многих ро­дов и видов плесневых грибов все они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов. Тело гриба состоит из длинных переплетенных нитей сероватого или белого цвета, называемых гифами. Гифы распространяются по поверхности питательного субстрата, образуя мицелий и частично врастают в него. Некоторые гифы, поднимающиеся над поверхностью в виде легкого пушка, имеют более сложное строение и представляют собой органы плодоношения, называемые конидие или спорангиеносцами. У мукоровых грибов на конце спорангиеносца находится шаровидное вздутие, окруженное оболочкой, внутри которого образуются споры. У аспергиллов конец конидиеносца име­ет булавовидное утолщение, от которого отходят удлиненные клетки, называемые стеригмами; от стеригм отшнуровываются более мелкие круглые клетки — конидии.

Отделившиеся конидии или споры, попадая в благоприятные условия, начинают прорастать, затем гифы ветвятся, образуя мицелий; при истощении питательных веществ в среде гриб переходит - в стадию споро- или конидиебразования. Споры и конидии плесневых грибов содержат пигменты, что и придает зрелым культурам характерную окраску.

На рис. 55 показана морфология плесневых грибов. Для осахаривания на спиртовых заводах чаще используются аспергиллы: при поверхностном культивировании — Asp. oryzae и Asp. awamori, а в последнее время высокоактивный по глюкоамилазе штамм Rhizopus delemar В; при глубинном культивировании — Asp. niger, Asp. usamii

Рис. 55. Плесневелые грибы:

1 – Asp. Oryzae; 2 - Asp. Niger, 3 – Penicillium, 4 – Mucor, a – мицелий; б – конидиеносцы в - конидии и споры

Asp. awamori и Asp. Batatae. На спиртовых заводах США используется высокоактивный штамм Asp. ашатоп МКК-3112.

Аспергиллы являются типичными аэрофилами, поэтому они мо­гут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная темпера­тура для, большинства аспергиллов 25—30°С, для некоторых — до 35°С. Большинство грибов при поверхностном культивировании мо­гут переносить кратковременное повышение температуры до 40 и даже 45°С без заметной потери активности ферментов. Оптималь­ная влажность среды для них около 65%.

Для питания аспергиллов необходимы азотистые и минеральные вещества. В качестве источника углевода кроме моносахаридов, многих олиго- и полисахаридов могут служить спирты и органические кислоты, однако для накопления амилазы в среде обязательно должны присутствовать крахмал, декстрины или маль­тоза. На средах, содержащих другие сахара, в том числе глюкозу грибы амилазы не образуют. Источником азота могут быть белки и их гидролизаты, аммонийные соли и нитраты.

Среда должна содержать соединения, в состав которых входят сера, фосфор, калий, магний и микроэлементы. Большинство плес­невых грибов усваивают серу из сульфатов, а фосфор — из солей фосфорной кислоты. Аспергиллы не нуждаются в готовых витами­нах и факторах роста, так как способны сами синтезировать их из более простых химических соединений, содержащихся в среде. Пре­параты ферментов из плесневых грибов содержат, как правило, ши­рокий набор ферментов, поэтому во многих случаях могут пол­ностью заменять зерновой солод.

В последнее время на спиртовых заводах стал широко применяться высокоактивный по глюкоамилазе штамм Asp.awamori-466, выращиваемый на концентрированном кукурузном сусле 18% сухих веществ). Готовая культура имеет активность до 250ед. ГлА на 1 мл, но других амилолитических ферментов, а также протеазы практически не образует. В связи с этим эту культуру целе­сообразно применять в смеси с другими культурами, продуцирую­щими a-амилазу и протеолитические ферменты.

Существует два способа культивирования микроорганизмов продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный.

Первый способ, применяемый для культивирования плесневых грибов, характеризуется развитием мицелия на поверхности твердо­го или жидкого субстрата. На жидком субстрате образуется пленка мицелия, продуцирующего не только амилолитические ферменты, но и органические кислоты, инактивирующие их, поэтому пользуют­ся твердыми субстратами с развитой поверхностью — пшеничными отрубями, дробиной барды, картофельной мезгой и др.

Максимальная активность ферментов достигается при культиви­ровании грибов на пшеничных отрубях. Дробина барды бедна пита­тельными веществами, и активность ферментов в культурах грибов, выращенных на ней, в 4—5 раз ниже, чем на отрубях. Зрелая куль­тура грибов вследствие обволакивания частиц отрубей мицелием имеет вид плотной войлокообразной массы.

При поверхностном культивировании пшеничные отруби должны быть увлажнены и стерилизованы. В стерильных условиях готовят посевную культуру, но выращивают гриб в нестерильных условиях в кюветах, устанавливаемых в растильных камерах. Тепло, выделя­ющееся в процессе роста грибов, удаляется продуванием через растильную камеру кондиционированного воздуха.

Поверхностный способ выращивания плесневых грибов имеет ряд преимуществ. Так как во время роста гриба отруби не переме­шиваются, посторонние микроорганизмы не распространяются по всей их массе и вызывают лишь незначительное местное инфицирование, которое, как правило, не влияет на активность ферментов. Это, однако, не исключает необходимости тщательной стерилизации среды и оборудования. Культуру на отрубях высушивают до содер­жания влаги 10—11%. В таком виде она может храниться продолжительное время без значительной потери активности. Это позволяет организовать централизованное снабжение спиртовых заводов сухой культурой плесневых грибов, что является одним из преимуществ поверхностного способа выращивания.

Недостаток поверхностного способа — необходимость установки множества кювет, работу с которыми трудно механизировать. Себе­стоимость культуры гриба-продуцента высока, причем в основном из-за затраты большого количества ручного труда. Механизация процесса выращивания возможна путем создания непрерывно действующих установок или бескюветных аппаратов с вертикальным толстым слоем питательной среды и интенсивным продуванием воз­духа через этот слой.

Глубинную культуру микроорганизмов выращивают на жидкой питательной среде при энергичной аэрации в герметически закры­тых аппаратах и в стерильных условиях. Процесс полностью меха­низирован. Стерильность глубинной культуры микроорганизма — продуцента ферментов положительно отражается на результатах сбраживания сусла дрожжами.