Дифференциация патогенных и сапрофитных лептоспир по

Таблица 50 - Лептоспиры, поражающие животных в России

Таблица 49 - Основные возбудители лептоспироза у животных

(Bergey, 1984)

Вид животного	Серогруппы лептоспир
Крупный рогатый скот Мелкий рогатый скот Лошадь Свиньи Собаки	Canicola, Grippotyphosa, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Sejroe, Tarrasovi. Grippotyphosa, Hebdomadis, Pomona, Sejroe, Tarrasovi Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi Canicola, Hebdomodis, Icterohaemorrhagiae, Sejroe, Pomona, Tarassovi Canicola, Icterohaemorrhagiae, Pomona

Лептоспиры	Вид животных
	Свиньи	Крупный рогатый скот	Мелкий рогатый скот
Основные Редко встречающие­ся	Pomona, Tarassovi Hebdomadis, Canicola, Gryppotyphosa, Icterohaemorrhagiae	Hebdomadis, Pomona, Tarassovi, Gryppotyphosa Canicola, Icterohaemorrhagiae	Gryppotyphosa, Pomona, Tarassovi Canicola, Icterohaemorrhagiae

Микроскопическое исследование исходного материала. В исследуемом материале лептоспиры обнаруживают в неокрашенном со­стоянии при помощи темнопольной микроскопии, реже — в окрашенных препаратах.

Темнопольная микроскопия. Для лабораторных исследова­ний применяют сухие системы с увеличением 400-500 раз. Готовят препарат «раздавленная капля». Толщина предметных стекол не должна быть больше 1-1,2 мм, покровных — 0,2 мм, в противном случае препарат не оказывается в фокусе конденсора. Стекла должны быть без царапин, чис­тые, обезжиренные. На верхнюю линзу конденсора помещают каплю дис­тиллированной воды, конденсор поднимают до уровня поверхности пред­метного столика, чтобы вода контактировала с предметным стеклом. В капле исследуют не менее 50 полей зрения.

При оптимальной настройке микроскопа лептоспиры в препарате вид­ны па темном фоне как спиралеобразные, тонкие серебристо-белые нити с Первичными завитками в виде тесно примыкающих друг к другу зерен. Концы лептоспир утолщены и оба или один загнуты, размер клеток 0,1 x 6-25 мкм. В жидкой среде лептоспиры движутся, вращаясь то в одну, то в другую сторону вокруг длинной оси, поступательно перемещаясь незагнутым концом вперед. В вязких средах движение может происходить по типу Волнового, винтового и змеевидного. В препаратах из нативного материала часто могут присутствовать клетки, потерявшие Способность к движению.

Кусочки паренхиматозных органов растирают в ступке с небольшим Количеством физиологического раствора (1:2-3), центрифугируют для осаждения крупных частиц в течение 10 минут при 3000 об/мин или отстаи­вают 1-2 часа при 4-6°С. Исследованию подвергают надосадочную жидкость. Мочу исследуют сразу после взятия и центрифугирования (10-12 тыс. об/мин, 30 минут).

Нитратную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение
5 минут, отсасывают надосадочную жидкость, повторно центрифугируют ее в течение 30 минут при 10-15 тыс. об/мин, осадок исследуют. При этом не­обходимо учитывать, что артефактные структуры, напоминающие лептос­пиры (нити фибрина, оболочки эритроцитов и др.), неподвижны.

Приготовление и микроскопия окрашенных препаратов лептоспир. Леп­тоспиры плохо воспринимают красители. Могут быть использованы следу­ющие методы окраски.

Окраска по Ромаповскому-Гимза. Мазки фиксируют спирт-эфиром (1:1) или метанолом — 3 минуты, окрашивают 8-12 часов красителями (0,5 мл краски и 10 мл нейтральной дистиллированной воды). Лептоспиры в пре­парате имеют светло-розовый цвет.

Окрашивание риванолом или аурамином по B.C. Киктенко. Используют для окраски препаратов из культур лептоспир. Тонкий ма­зок фиксируют легким нагреванием, наносят раствор 3%-ной серной кислоты и подогревают мазок в течение 1 минуты, промывают водой. На препарат наносят риванол или аурамин (1:1000), высушивают. Лептоспиры приобретают зеленоватый оттенок (риванол) или золотистый (аурамин) цвет.

Импрегнация серебром по B. Babudieri. Мазок фиксируют жид­костью Руге в течение 1-2 минут, промывают водой, наливают на препа­рат раствор танина и прогревают до появления паров, промывают в про­точной, а затем дистиллированной воде. На несколько секунд на мазок наливают раствор азотнокислого серебра, а затем заменяют раствор на свежий и подогревают до появления коричневой окраски с металлическим отливом, промывают препарат в проточной воде. При микроскопии лептоспиры имеют черный цвет на светло-коричневом фоне.

Жидкость Руге: ледяная уксусная кислота — 1 мл, формалин (40%-ный) —2 мл, дистиллированная вода —100 мл.

Раствор танина: танин — 5 г, фенол — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл.

Раствор азотнокислого серебра: к 1%-му раствору азотнокислого се­ребра в дистиллированной воде добавляют по каплям 10%-ный раствор аммиака до исчезновения первоначально выпавшего осадка и просветле­ния раствора. Раствор хранят в склянке темного стекла.

Импрегнация лептоспир серебром в гистологических срезах по Левадити. Кусочки органов (корковый слой почек, печень) толщиной 0,2-
10 мм фиксируют 24-48 часов в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина, затем переносят в 96%-ный этанол на 24 часа, выдерживают 3 часа в дистиллированной воде, трех­кратно заменяя ее на свежую.

На следующем этапе материал помещают в 1-3%-ный раствор азотно­кислого серебра на дистиллированной воде на 3-6 суток при 37° С. Мате­риал промывают в дистиллированной воде 2-5 минут, переносят на 2 ми­нуты в небольшое количество раствора редуцирующей смеси и далее в ос­новной редуцирующий раствор (пирогаллоловая кислота — 4 г, формалин чистый — 5 мл, дистиллированная вода — 100 мл) в банке темного стекла, выдерживают в растворе 24-48 часов при комнатной температуре. Реду­цирующую смесь берут из расчета 20-25 мл на кусочек ткани. Длитель­ность экспозиции контролируют приготовлением единичных срезов через каждые 12-16 часов.

При изготовлении срезов материал промывают в дистиллированной воде 1-2 часа. Затем последовательно обрабатывают 96%-ным этанолом 24 часа, новой порцией 96%-ного этанола 24 часа и снова 24 часа свежим спиртом. Далее материал помещают в спирт-метил (спирты этиловый и метилсалициловый поровну) до опускания кусочков на дно сосуда, затем помеща­ют на ночь в метилсалициловый спирт.

Материал переносят в парафиновую кашу (парафин и ксилол поровну) на 30 минут при 57°С, далее в парафин на 60 минут при 57°С и в свежий парафин при 57°С на 60 минут.

Парафин быстро остужают, вырезают блок с кусочком органа и на­клеивают на деревянный кубик. На сапном микротоме готовят тонкие срезы, наклеивают на предметное стекло, депарафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10-15 минут и заключают под покровное стекло в бальзам. Готовые препараты хранят в темноте.

Микроскопическая картина: лептоспиры — черные, ткань — беловато-желтая. После импрегнации серебром лептоспиры обычно имеют
S-образную с 1-2 изгибами или змеевидную форму.

Индикацию лептоспир в исследуемом материале можно проводить ме­тодом флуоресцирующих антител.

Выделение и идентификация лептоспир. Культивирование. Лептоспиры — аэробы, температурный оптимум 28-30°С, рН 7,2 - 7,6, концентрация натрия хлорида в среде — 0,05%, рост на питательных средах замедленный, первичные посевы на жидких питательных средах вы­держивают до трех месяцев. Культуры чаще вырастают через 7-20 дней, редко — через 2-3 месяца.

Первичные посевы материала обычно производят на жидкие питатель­ные среды. Для длительного хранения культур могут быть использованы полужидкие среды, с целью исследования физиологии, антигенной струк­туры — плотные среды.

Кровь высевают в количестве 3-5 капель в 5-7 пробирок с жидкой питательной средой. Посмертно посевы производят из крови сердца, ткани почек (из коркового слоя), печени, у абортированных плодов — также из содержимого желудка. Рекомендуется материал, контаминированный посто­ронней микрофлорой (моча), пропускать через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и засевать в среды, содержащие 5-флуороурацил в концентрации 200 мкг/мл. Посевы производят пастеровскими пипетками в 3-5 пробирок.

При поддержании лептоспир в лаборатории культуры пересевают пас­теровскими пипетками, причем объем исходной культуры должен состав­лять приблизительно 0,1 объема свежей среды, так как при малой посевной дозе рост бывает замедленным и скудным. Интервал пересевов культур 10-15 суток.

С целью длительного хранения без лиофилизации культуры лептоспир в пробирках заливают вазелиновым маслом, держат в темноте при комнат­ной температуре. В таких условиях лептоспиры сохраняют жизнеспособ­ность до трех месяцев.

Характер роста лептоспир на питательных средах. При размножении в жидких питательных средах лептоспиры практичес­ки не изменяют внешнего вида среды, поэтому наличие роста устанавлива­ют при помощи исследования среды из всех засеянных пробирок в препарате «раздавленная капля» методом темнопольной микроскопии через каж­дые 3-5 дней на протяжении трех месяцев.

В полужидких питательных средах рост в виде интенсивно опалесцирующего кольца обнаруживается невооруженным глазом на расстоянии 3-5 мм ниже поверхности среды. Культуры на полужидких средах выращива­ют для длительного хранения.

На плотных питательных средах (с 1% агара, 10% сыворотки кро­ви) лептоспиры образуют колонии S-, О-, R-формы. Колонии патоген­ных и сапрофитных лептоспир могут быть разнообразными: росинчатыми, круглыми диаметром 2-4 мм, кольце­видными, астровидными, с сосочковидным центром, неправильной фор­мы. Различает три фазы развития колоний: пери­од поверхностного роста, период внедрения в агар, период глубокого врастания. В конечной фазе могут формироваться крупные до 3-4 см в диаметре колонии. Колонии патогенных лептоспир вырастают на 6-20-е сутки, чаще на 7-8-й день, сапрофитные — 3-6-й день. Колонии S-формы — круглые, прозрачные, дисковидные, с тонкой периферий­ной каймой. Колонии R-формы имеют неправильную хлопьевидную конфигурацию.

Для очистки загрязненных культур рекомендуется осуществлять фильт­рацию через пластины марки «СФ» с последующим засевом фильтрата в жидких питательных средах.

Также может быть использован дробный рассев на поверхность плот­ных питательных сред в чашках Петри. Субкультуры из колоний отвивают на жидкие среды.

Свежевыделенные штаммы лептоспир можно сохранять без пересевов в течение года, если получено хорошее накопление, а культура разлита по ампулам, которые запаивают и хранят при 20° С. Культуры в пробирках, под слоем вазелинового масла, в темноте, при комнатной температуре со­храняют жизнеспособность до трех месяцев. Аналогичным образом на среде Терских удобно со­хранять лептоспиры до 5- 8 недель.

Морфология клеток лептоспир в культуре. Морфология лептоспир в культуре и исходном материале различий не имеет. Препарат из культур (помимо темнопольной микроскопии в живом состоянии) можно, в случае необходимости, окрашивать, хотя лептоспиры слабо воспринимают красители.

В колониях на плотных питательных средах через 10-14 суток куль­тивирования лептоспиры подвижны и хорошо делятся, позднее в цент­ре колонии находят густо переплетенные мертвые лептоспиры, а по пе­риферии — молодые, делящиеся.