Бактериологическое исследование
Лабораторная диагностика эмфизематозого карбункула
Выделение и идентификация культуры возбудителя
Возбудитель, как и все клостридий, анаэроб, его первичная изоляция из исследуемого материала представляет трудности. Посев материала производят в глюкозный бульон с 8% цитратной овечьей плазмы, тиогликолатный бульон с 8-10% сыворотки крови овцы, заражают 5-8-дневные куриные эмбрионы. На этих средах возбудитель необходимо пассажировать несколько раз, прежде чем производить высев на глюкозо-кровяной агар. Контаминированный материал высевают на среды с добавлением 25 мг/см3 полимиксина В. У выделенных культур
С. colinum исследуют ферментативные характеристики.
Для вида характерно отсутствие лецитиназы, липазы, желатиназы, ка-зеиназы, образование индола, кислоты из глюкозы, сахарозы, мальтозы, но не лактозы.
Эмфизематозный карбункул — остропротекающая неконтагиозная инфекционная болезнь крупного и мелкого рогатого скота, характеризующаяся появлением в мускулатуре крепитирующих отеков.
|
|
Возбудитель — С. chauvoei. Лабораторная диагностика основана на результатах бактериологического исследования.
Для исследованияиз пораженных участков стерильным инструментом вырезают кусочки ткани 3x3x3 см3, при вскрытии трупа также берут кусочки печени, селезенки, кровь сердца. Материал должен быть взят не позднее 4 часов после гибели животного. В теплое время года материал консервируют 30%-ным раствором глицерина.
Микроскопическое исследование исходного материала. Готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму, Муромцеву. В окрашенных препаратах возбудитель виден как грамположительные палочковидные бактерии размером 0,5-1,6x1,5-9,6 мкм, с закругленными концами, тенденцией к полиморфизму (грушевидные, веретенообразные, шаровидные формы), с центральными и субтерминальными спорами. Иногда возбудитель образует цепочки из 3-5 клеток, но, в отличие от C.septicum, в мазках с серозных оболочек не имеет форму нитей.
Культивирование. С. chauvoei — строгий анаэроб, требует разрежения до 5-10 мм ртутного столба. Температурный оптимум 36-38° С. Посев на питательные среды производят предварительно профламбированными кусочками тканей, жидкий материал высевают пастеровскими пипетками. В качестве питательных сред используют среду Кита-Тароцци, кровяной агар (кровь овцы) с печеночным экстрактом глюкозо-кровяной агар Цейсслера. Для получения изолированных колоний посев материала желательно производить на 3-4 чашки Петри.
Параллельно производят посевы на МПА и МПБ, для исключения аэробной микрофлоры. Несвежий материал целесообразно растереть в ступке со стерильным физиологическим раствором (1:4), прогреть при 80° С в течение 15-20 минут и затем посеять на питательные среды. Рекомендуется также посев на МППБ с 0,5% карболовой кислоты. После инкубирования и выявления споровых клеток в окрашенных препаратах со дна пробирки пастеровской пипеткой отбирают 3-5 мл среды, прогревают до 60° С в течение 30 минут и рассевают на плотные среды.
|
|
При использовании метода посева в глубину сывороточного агара исходный материал (0,5 мл) засевают в пробирку с расплавленным и остуженным агаром, затем этой же пипеткой производят последовательный перенос материала из этой пробирки еще в четыре пробирки с агаровой средой. Содержимое 4 и 5 пробирок переливают в трубки Виньял-Вейона. Выросшие колонии отвивают на среду Кита-Тароцци и глюкозо-кровяной агар. Посевы в чашках инкубируют в строго анаэробных условиях в анаэростатах, лучше с 10% СО2 при 37° С в течение 2-4 дней, пробирки со средой Кита-Тароцци выдерживают в термостате 1-2 суток при 37° С.
Заключение о целесообразности обработки материала с целью деконта-минации от посторонней микрофлоры делают на основании результатов микроскопического исследования материала.
Характер роста возбудителя на питательных средах. На среде Китта-Тароцци рост С.chauvoei сопровождается равномерным легким помутнением среды, слабым газообразованием, через 2-3 суток среда просветляется и формируется рыхлый беловатый осадок. Старые культуры имеют запах прогорклого масла. Гнилостный запах и потемнение среды указывают на загрязнение. Скорость спорообразования зависит от ряда факторов и может варьировать от 24 до 72 часов. При получении смешанной культуры проводят дробный посев на глюкозо-кровяной агар в чашках Петри. В толще сывороточного агара возбудитель образует чечевицеобразные или круглые колонии с нежными отростками.
На кровяном агаре возбудитель формирует округлые колонии диаметром 0,5-3 мкм в большинстве случаев с небольшой зоной (β-гемолиза в виде «перламутровой пуговицы» (S-форма) или плоские с изрезанными краями в виде виноградного листа (R-форма). При посеве в мозговую среду последняя закисляется, есть газообразование, почернения нет, позднее в толще среды отмечается легкое покраснение. В молоке с кусочками печени рост обнаруживается уже через 16-18 часов при свертывании молока на 3-6-е, иногда на 14-е сутки.
Морфология клеток возбудителя в культуре. Из выросших культур готовят мазки, окрашивают по Граму. Клетки в мазках прямые или слегка изогнутые, полиморфные. Располагаются одиночно, парами, реже — цепочками, капсулу не образуют, перитрихи, споры овальные центральные или субтерминальные. В молодых культурах клетки возбудителя окрашиваются грамположительно, в старых имеют тенденцию к грамотрицательной окраске.
Идентификация возбудителя на основании изучения ферментативных свойств. Исследуемую культуру высевают на желточный агар, желатину, молоко, среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, салицином, проводят пробу на индол. Для C.chauvoei характерен гидролиз желатины, расщепление перечисленных углеводов с образованием кислоты, отсутствие утилизации салицина, образование лецитиназы, липазы, ка-зеиназы, индола. При исследовании ферментативных свойств, кроме классических сред и тестов, может быть использована система API20A для анаэробов (Analytab Products).
Биопроба. Проводят с целью выделения возбудителя из исследуемого материала или определения патогенных свойств выделенной культуры. Очистка загрязненного материала путем заражения морских свинок менее эффективна, чем посев на плотные кровяные среды. Тканевый материал растирают в ступке со стерильным МПБ (1:10), в объеме 0,5-1,0 м вводят подкожно в область брюшных мышц морским свинкам массой 350-400 г. За животными наблюдают в течение 8 суток. Гибель обычно наступает на 1-4-е сутки. При наличии в материале возбудителя на месте инъекции в коже обнаруживают кровоизлияния, геморрагический выпот. Кожа от пораженных мышц отделяется с трудом. Мышцы темно-красного цвета, в клетчатке немного газа, кишечник не вздут, желчный пузырь переполнен содержимым. Возможно наличие слабовирулентных штаммов, поэтому целесообразно внутримышечное введение материала с 1-2 каплями 20%-ого раствора молочной кислоты, подавляющей фагоцитоз. При подкожном заражении кролик не погибает (дифференцирующий признак).
|
|
Путем микроскопии мазков-отпечатков из тканей на месте инъекции отличить С. chauvoei от других возбудителей злокачественного отека достаточно сложно, за исключением С. septicum, который образует на серозных покровах длинные нити.