Нейтрализации

Таблица 57 - Определение типа токсина С. perfringens в реакции

Реакции нейтрализации

Таблица 56 - Идентификация токсинов С. perfringens в

Таблица 55 - Схема теста нейтрализации на мышах и интерпретация его результатов

Морских свинках

Таблица 54 - Схема постановки реакции нейтрализации на

Смеси фильтрата и	Тип токсина
антитоксических сывороток сывороток	А	В	С	D	Е
Необработанный	Бульон	+	+	+	±	+
фильтрат	Сыворотка типа А (анти-альфа)	-	+	+	(-)*±	±
	Сыворотка типа А + С (анти­альфа и анти-бета)	-	(-)*±	-	(-)*±	±
	Сыворотка типа А + С + D (анти-альфа, анти-бета, анти-эпсилон)	-	-	-	-	±
	Бульон	±	+	(-)±	+	+
Трипсинизиро-	Сыворотки типа А	-	+	(+)±	+	+
ванный фильтрат	(анти-альфа)
	Сыворотки типа А + D (анти-альфа, анти-эпсилон)	-	(-)±	(-)±	-	+
	Сыворотки типа А + С + D (анти-альфа, анти-бета, анти-эпсилон).	-	-	-	-	+
	Сыворотка типа А + Е (анти-альфа, анти-йота). Обычно не ставят из-за редкого присут­ствия йота-токсина	-	+	(-)±	+	-
Индентифицируемый токсин	α	β+ έ	β	έ	i

(-) * — почти всегда отрицательная, так как эпсилон-токсин находится в фор­ме протоксина. (-) — почти всегда отрицательная, так как бета-токсин разрушается трипсином.

Испытуемая жидкость (мл)	Типовая антисыворотка (мл)	Объем смеси, вво­димый мышам (мл)	Количество мышей
0,9	0,3 А	0,4
0,9	0,3 В	0,4
0,9	0,3 С	0,4
0,9	0,3 D	0,4
0,9	0,3 Е	0,4
0,9	Нет	0,4

Интерпретация результатов, полученных в течение трех дней:

1. Антитоксин А нейтрализует только гемологический токсин.

2. Антитоксин В нейтрализует токсины А, В, С и D.

3. Антитоксин С нейтрализует токсины А и С.

4. Антитоксин D нейтрализует токсины А и D.

5. Антитоксин Е нейтрализует токсины А и Е. Эти данные представле­ны в таблице 56.

Антитоксическая сыворотка	Тип токсина
	А (альфа)	В (альфа, бета, эпсилон)	С (альфа, бета)	D (альфа, эпсилон)	Е (альфа, йота)
А антиальфа	-	+	+	+	+
В антиальфа, -бета, -эпсилон	-	-	-	-	+
С антиальфа, -бета	-	+	-	+	+
D антиальфа, -эпсилон	-	+	+	-	+
Е антиальфа, -йота	-	+	+	+	-

+ гибель; - гибель отсутствует

В соответствии с «Методическими указаниями...» в лабора­ториях РФ реакцию нейтрализации рекомендуется проводить путем смешивания в отдельных пробирках 1 мл антитоксических сывороток (А, С, D, Е), содержащих в 1 мл 10АЕ и 1 мл фильтрата. В пятой пробирке смешивают фильтрат и физиологический раствор. Компоненты инкубируют 30 минут при 37° С и по 0,5 мл смеси вводят двум белым мышам внутривенно (внутрибрюшинно) или морским свинкам (кроликам) по 0,2 мл внутрикожно. Результат учитывают в течение двух суток при гибели контрольных мы­шей или образовании некроза у контрольных животных и интерпретируют по схеме, представленной в таблице 57.

Тип С. perfringens	Токсин в исследуемом материале	Антитоксическая сыворотка	Контроль
		А	С	D	Е
А	альфа	-	х	х	х	+
В, С, F	бета	+	-	+	+	+
D	эпсилон	+	+	-	+	+
Е	йота	+	+	+	-	+

Примечание к таблице 57

(+) — мыши пали, у морских свинок и кроликов некроз на месте введения;

(-) — мыши живы, у морских свинок и кроликов некроз отсутствует;

(х) — результат не учитывается

Выделение культуры С. perfringens, определение ее токсигенных свойств. С. perfringens является относительно аэротолерантным видом анаэроб­ных клостридий. Температурный оптимум для типов А и D составляет 45° С, В и С — 37-45° С.

Согласно «Методическим указаниям...» в лабораториях РФ рекомендуется посев из содержимого кишечника и паренхиматозных орга­нов делать на среду Кита-Тароцци с подавлением роста сопутствующей микрофлоры следующими способами. Применяют метод частых пересевов выросшей культуры с интервалом 2-3 часа на свежую среду Кита-Та­роцци или засеянные пробирки прогревают при 65° С в течение 10 минут и затем культивируют 18 часов при 38° С. Рост С.perfringens в среде Кита- Тароцци — быстрый (3-8 часов), характеризуется помутнением, бурным га­зообразованием, образованием гомогенного или слизистого осадка. Из выросших культур делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Клетки С. perfringens в мазках из культуры выглядят как короткие, толстые, грамположительные палочки с обрубленными концами, жгутиков не имеют. В старых культурах клетки образуют центральные или субтерми­нальные споры. При незначительной контаминации культуры посторонней микрофлорой производят дробный высев на глюкозо-кровяной агар Цейсслера. Посевы инкубируют при 37-38° С в течение суток.
С. perfringens на кровяном агаре формирует колонии трех типов диаметром 2-5 мм: S — гладкие, М — слизистые, R — махровые. Гладкие колонии первоначаль­но напоминают капельки росы, затем прозрачность исчезает, колонии при­обретают белую или сероватую окраску. Форма круглая, рельеф выпук­лый, поверхность блестящая, гладкая, края ровные.
М-колонии формиру­ют капсулообразующие клетки, они сходны с

S-колониями, но имеют слизи­стую консистенцию. Шероховатые колонии — неправильной формы, края фестончатые. По мере пребывания на воздухе колонии всех типов приобре­тают зеленоватый оттенок, что является характерным признаком. Колонии окружены зоной гемолиза, полного или частичного. Зона гемолиза может быть двойной: вокруг колоний полный гемолиз (действие гемолизинов), на отдалении — неполный (действие лецитиназы). Среда в процессе роста С. perfringens становится буро-коричневой.

Из типичных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроско-пируют. При обнаружении характерных для С. perfringens по морфологии и тинкториальным свойствам клеток культуру отвивают на среду Кита-Тароцци, выращивают 8-16 часов при 37-38° С и определяют в биопро­бе на мышах наличие токсина (методику см. выше).

Если предполагается наличие С. perfringens типов Е и D, токсин перед постановкой опыта на животных переводят из состояния протоксина в ток­син. Предварительно культуру подщелачивают до рН 8,0-8,2, вносят 0,25% трипсина или 0,5% панкреатина и выдерживают, встряхивая, 2 часа при 37-38° С. При наличии токсина типа С токсичность снижается, В — со­храняется, D и Е — увеличивается. Тип токсина устанавливают в реакции нейтрализации, как указано выше. В настоящее время фирма Techlab Inc. выпускает диагностический набор для иммуноферментного выявления токсинов возбудителя в содержимом кишечника. Перспективно применение для идентификации токсичных штам­мов С. perfringens ПЦР-диагностики.

С целью идентификации выделенных культур на видовом уровне изу­чают их ферментативные свойства. Для С. perfringens характерно нали­чие лецитиназы, желатиназы, казеиназы, способности расщеплять с обра­зованием кислоты глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, свертывать мо­локо за 8-10 часов, при этом образуются прозрачная сыворотка и рых­лый сгусток казеина. Принимают во внимание, что штаммы типа А рас­щепляют инулин, но инертны по отношению к глицерину, типа Д утилизи­руют глицерин, но не инулин, типы В и С не разлагают оба эти углевода. Также используют тест-системы API 20A, Anacrotest 23 и др. С. perfringens — единственный вид клостридий, образующий капсулу, жгу­тиков не имеет.

Характер патологоанатомических изменений у морских свинок, зара­женных подкожно, описан в разделе «Злокачественный отек».