Микроскопическое исследование исходного материала
Бактериологическое исследование
Наружные половые органы обмывают антисептическим раствором (КМnО4 1:1000), осушают салфетками. Стерильными тампонами берут пробы слизи из препуциальной ямки головки клитора (клиторные пробы). Цервикальные пробы (цервикальная слизь) берут при помощи стерильных полистироловых осеменительных пипеток и влагалищного зеркала. У жеребцов объектом исследования являются пробы, взятые увлажненными тампонами с головки пениса, препуция, уретрального капала.
Возбудитель отличается слабой устойчивостью. Материал доставляют В лабораторию не позднее 3-4 часов после взятия. Лучше для транспортировки использовать специальную среду Timoney P.Y. и соавт. (1982). Если материал до посева выдерживают в закисленной среде (рН 4), то возбудитель погибает в течение 3-5 минут.
Этот метод исследования дает информацию только при клинически выраженной инфекции в случае исследования воспалительного экссудата из матки. Мазки окрашивают по Граму. Возбудитель в окрашенных препаратах грамотрицательный, имеет форму коротких палочковидных, вплоть до кокковидпых клеток размером 0,7 х 0,7-5,0 мкм.
|
|
Культивирование. Возбудитель — микроаэрофил (10% СО2), температурный оптимум 36-37° С (диапазон 30-42° С), рН 7,2-7,6; на обычных средах не растет, на кровяном и сывороточном агаре не растет или рост очень слабый; хорошо культивируется на «шоколадном» агаре, но зависимости от присутствия V-или Х-ростового факторов не проявляет. В условиях обычной атмосферы или в анаэробных условиях возбудитель растет плохо. Материал дробно высевают на «шоколадный» агар в чашках Петри. Используют для изготовления среды кровь лошади. Поскольку материал содержит сопутствующую микрофлору, целесообразно проводить посев на селективные среды со стрептомицином, амфотерицином и кристаллвиолетом. Возможно выделение стрептомициночувствительных штаммов, поэтому рекомендуется посев производить одновременно на две селективные среды: «шоколадный» агар со стрептомицином и «шоколадный» агар с амфотерицином и крисгаллииолетом (Тейлор К. и соавт., 1978).
Посевы инкубируют при 37° С в атмосфере 10% СО2 Макроскопически видимый рост обычно появляется через 48 часов, но иногда позднее, поэтому в отрицательных случаях посевы рекомендуется выдерживать до 7 суток.
На «шоколадном» агаре через 2-4 суток инкубирования в оптимальных условиях формируются круглые, выпуклые, с блестящей поверхностью и конусовидным центром полупрозрачные колонии, первоначально диаметром 0,25-1 мм, позднее — до 1,5-3 мм, цвет колоний от светло-кремового до коричневого.
|
|
На кровяном агаре колонии имеют диаметр 0,3-1 мм, цвет от светло-белого до коричневого, заметна зона ά-гемолиза, которая отчетливо видна только на 5-7-й день культивирования. Гемолитическая активность в большей степени проявляется при использовании эритроцитов лошади и в меньшей — овцы.
Характерна консистенция колоний на плотных питательных средах. При надавливании бактериологической петлей колонии скользят по поверхности среды. После помещения бактериальной массы старых культур в воду образуется гель, что заметно при изготовлении мазков для окраски по Граму.
В жидких питательных средах (сердечно-мозговой бульон) на 3-4-е сутки инкубирования рост возбудителя проявляется легким помутнением среды.
Морфология клеток возбудителя в культуре. В мазках из культур, окрашенных по Граму, возбудитель представляет собой грамотрицательные палочковидные клетки (0,7 х 0,7-1,8 мкм), иногда почти сферические. Могут быть выявлены нитевидные формы, капсулы и жгутиков нет.
Идентификация возбудителя по ферментативным свойствам. Вид T.equigenitalis является на сегодня единственным представителем рода, но при бактериологическом исследовании могут быть выделены сходные виды бактерий других родов, от которых возбудитель необходимо дифференцировать на первом этапе исследования: Wolinella recta, Bacteroides ureolyticus и Bacteroides gracilis. Перечисленные виды обитают в организме человека и в исследуемом материале могут присутствовать как контаминанты. С указанной целью определяют у выделенных культур подвижность, наличие уреазы, оксидазы, способность к восстановлению нитрата и нитрита. Для дальнейшего изучения отбирают бактерии, не имеющие жгутиков, не образующие уреазу, обладающие оксидазной активностью, не редуцирующие нитраты и нитриты.
У культур контролируют отсутствие способности к росту в обычной атмосфере, наличие фосфатазы. Фосфатазную активность проверяют следующим образом: в 0,5 мл трисбуфера (рН 8,0) суспензируют несколько подозрительных колоний, добавляют 0,5 мл раствора
р-нитрофенилфосфата (1 мг/мл), смесь выдерживают при 37° С в течение 2 часов. Положительный результат — желтое окрашивание. T.equigenitalis вырабатывает фосфатазу. В случае необходимости проверяют другие ферментативные свойства и ростовые потребности. Для Т.equigenitalis свойственно отсутствие потребности В V-и
Х-ростовых факторах, хотя последний несколько стимулирует рост, отсутствие синтеза лецитиназы, утилизации цитратов, продукции индола, сероводорода, Р-галактозидазы, желатиназы, аргинин и лизиндекарбоксилазы, оксидации глюконата, образования кислоты из сахарозы, глюкозы, мальтозы, арабинозы, рибозы, ксилозы, эскулина, декстрозы, дульцита, галактозы, маннозы, маннита, рамиозы, сорбита, целлобиозы, лактозы, раффинозы.
Сахаролитические свойства испытывают посевом на среды Гисса с 10% сыворотки крови, 1% испытуемого углевода, 0,002% бромкрезола пурпурового.
Серологическая идентификация возбудителя. При наличии гипериммунных сывороток возможна идентификация возбудителя в реакции агглютинации или коагглютинации. РА на стекле целесообразно использовать на стадии отбора подозрительных колоний, при этом допускается слабая спонтанная агглютинация бактерий в контроле с физиологическим раствором. Более специфической и чувствительной считается реакция коагглютинации. Антительный диагностикум готовят обычным способом, используя стафилококк, содержащий А-протеин. Для отчетливой агглютинации необходимо, чтобы исследуемая бактериальная суспензия содержала как минимум 6x10s клеток возбудителя. Одновременно ставят контроль на спонтанную агглютинацию. Учет результатов проводят через 5 минут.
Идентификация T.equigenitalis в ПЦР. Разработана тест-система для выявления возбудителя в исследуемом материале в реакции цепной полимеризации. Учитывая сложность культивирования возбудителя и его выделения, особенно в случае исследования бактерионосителей, применение ПЦР оправдано при оценке статуса животных, предназначенных на экспорт.