Серологическая идентификация

ИФ. Аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции. Этим методом АГ ВД обнаруживают в клетках слизистой оболочки прямой кишки, селезенки, легких и лим­фоузлов экспериментально зараженных животных. Изучено распределение АГ ВД-БС в тканях животных остром и хроническом течениях болезни. В лимфоидных тканях АГ рас­полагается в клетках системы фагоцитирующих мононуклеаров. Между первоначальным обнаружением АГ в слизистой кишечника, кератинизированном эпителии верхних отделов пищеварительной системы и кожи и прогрессированием патологических признаков имеется скрытый период.

ИФ биопсийного материала слизистых оболочек ротовой и носовой полостей пригодна для ранней прижизненной диагностики вируса диареи. ИФ для обнаружения АГ вируса в клетках из носоглоточных смывов - надежный и быстрый способ выявления животных, персистентно инфицированных вирусом. При исследовании препаратов обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме не разрушенных клеток. Яркая зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. Удобным оказался непрямой метод ИФ с использованием конъюгированных РаЬ-фрагментов АТ из гипериммунной свиной сыворотки против ВД-БС КРС. Специфическая флюоресценция вирусного АГ в культуре бычьих макрофагов обнаруживалась в цитоплазме клеток. Для идентифика­ции не цитопатогенных изолятов метод ИФ практически единственный. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной флюоресценции проводят окон­чательное типирование вируса в РН.

РН. Это основной метод идентификации вируса. Новые изоляты возбудителя ВБ-БС, не обладающие цитопатогенной активностью, могут быть идентифицированы при помощи ги­периммунной сыворотки к вирусу диареи по подавлению феномена экзальтации вируса НБ, который используют для индикации подобных штаммов.

РДП. Обеспечивает быструю и точную постановку диагноза, однако пока чувствитель­ность метода невелика, и его следует использовать в комплексе с другими методами лабора­торной диагностики и идентификации возбуди теля. Приготовление испытуемого АГ и ме­тодика постановки РДП описаны ранее. Антисыворотку для РДП готовят на КРС. Для иммунизации животных используют нитрированную кровь, взятую асептически от экс­периментально зараженных животных в период подъема температуры. Кровь вводят внут­ривенно (некоторым животным делают несколько таких инъекций). Кровь берут через 60-90 I дн после инокуляции.

Выявление вируса ПЦР. Данный метод рекомендован для быстрой диагностики ВД-БС. После цикла обратной транскрипции образцы ткани инфицированной культуры клеток. подвергают амплификации с использованием праймеров, обеспечивающих репликацию оп­ределенного сегмента гена белка gр48 ВД. Для обнаружения амплифицированных последо­вательностей используют электрофорез в ПААГ и гибридизацию с биотинилированным, ДНК-зондом на последовательности генома вируса лейкоза. При идентификации молочных стад, инфицированных вирусом ВД-БС КРС, также предложен метод ПЦР для работы с пробами молока. Вирусную ДНК выделяют из соматических клеток цельного мо­лока методом экстракции изотиоцианатом гуанидина и фенолом-хлороформом. При острой инфекции РНК вируса обнаруживалась через 6-10 дн после заражения, а при хронической - с использованием обоих праймеров (5'-нетранслируемая область (S'-НТ) и область р80) до разведения молока 1:640. ПЦР оказалась в 14,6 раза чувствительнее других методов выде ления вируса. Для выяснения РНК ВД методом ПЦР необходимо не менее 580 соматических клеток, тогда как для выделения вируса - не менее 8500 клеток. Чувствительность и специфичность ПЦР подтверждена гибридизацией по Соузерену.Чувствительность метода превышает чувствительность выделения вируса в культуре клеток в 10²-10⁴ раза. Показана возможность обнаружения персистентной инфекции ВД-БС КРС методом ДНК-гибридизации и ПЦР.

Биотинилированные зонды комплементарной ДНК уже широко используются для обна­ружения пестивирусов (КЧС, ВД-БС КРС и ПБО). В Бельгии разработан метод обнару­жения специфических АТ к ВД с помощью ИФА, проводимого с рекомбинантным АГ и монАТ. ИФА с монАТ удобен для выявления виремии у животных; с его помощью в лейкоцитах обнаруживали 2 родственных неструктурных белка (р80К и р120-130К). Вирус­ный АГ был обнаружен в В- и Т-лимфоцитах, моноцитах. Помимо общепринятого ме­тода ИФА предложена иммуноферментная реакция захвата АГ ВД КРС в лимфоцитах пе­риферической крови КРС. В реакции для захвата АГ используют монАТ к консервативному АГ домену неструктурного белка (р125/р80) ВД.

Кроме ИФА разработан и предложен метод взаимодействия специфической антисыво­ротки с вирусным АГ ВД в лимфоцитах инфицированных животных с помощью проточной цитометрии. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Для повы­шения чувствительности реакции лимфоциты фиксируют, их клеточные мембраны солюбилизируют, и вирусный АГ выявляют при использовании биотинилированных Ig из антисы­воротки свиней с последующей инкубацией с ФИТЦем, конъюгированным авидином.

ИФА. ИФА позволяет легко идентифицировать культуры клеток, инфицированные В Д. Идентификация с помощью монАТ в практическом диагностическом применении не разра­ботана. Однако получено 5 монАТ (XI А9, АЕЗЕ2, АМ2G5, ВТ48, ВТ6G9) против вируса ВД-БС КРС с ВН-активностью, которые позволили разделить изоляты ВД на 4 группы. По­лучена и изучена панель монАТ против Singer-изолята, с помощью которой были обнару­жены полипептиды мол.м. 56-58 кД и доказано, что гликопротеин, локализуется на поверх­ности вирионов и является носителем нейтрализующих эпитопов. Анализ с панелью монАТ показал АГ гетерогенность среди изолятов этого вируса.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Серодиагностика заболевания затруднительна, так как при хроническом течении инфек­ции АТ обнаруживаются непостоянно и бывают в невысоких титрах. Диагноз на про­шедшую инфекцию, а также латентное вирусоносительство обычно ставят при помощи РН в культуре клеток, определяя титры АТ в сыворотках реконвалесцентов. Для этого лучше ис­следовать парные сыворотки, взятые с интервалом 3-4 нед. При диагностике скрытого тече­ния инфекции чаще используют сыворотки крови убойного скота, поступающего с клиникой не диагностированной инфекции кишечного и респираторного трактов. Обычно в таких слу­чаях процент положительных сывороток (титры от 1:16 до 1:128) варьирует в широких пре­делах и может достигать 30-50 (иногда до 80). У клинически здоровых животных процент положительных проб может колебаться от 6-8 до 20-30. Динамика появления и угасания титров ВНА недостаточно изучена. Перед исследованием сыворотки прогревают в водяной бане при температуре 57-58°С 30 мин.

В США разработан быстрый количественный метод титрования ВД КРС. Он состоит в микротитровании с использованием цитопатогенных и не цитопатогенных изолятов вируса и перевиваемой линии клеток бычьей почки - МДВК. Для этого серийные разведения вирус-содержащей жидкости и суспензию клеток в концентрации 1-10⁵ в среде с 2% сыворотки крови лошади заливают в лунки пластин Теrasaki и проводят микротитрование в НИФ, ко­торую учитывают на дне лунок пластин, используя водно-иммерсионный объектив микро­скопа. Вирус также титруют и по бляшкообразованию. Специфическую флюоресценцию в клетках наблюдали уже через 12 ч после заражения, окончательные результаты считали че­рез 72 ч инкубирования. Результаты титрования вируса по бляшкам и в микротитровании совпадали. Микротитрование вируса по ИФ имеет ряд преимуществ над стандартным методом титрования по бляшкам: требует меньше времени и материалов и особенно незаменимо при титровании не цитопатогенных изолятов ВД.

РН. Её ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой стам дартного вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Положительными считают сыворотки титром АТ 1:16 и выше, в парных сыворотках - повышение титра АТ во второй пробе в раза и более. При экспериментальном заражении у всех телят через 15-61 день обнаруживали ВНА в титре 1:64 - 1:1024. Реакция, суть которой заключается в подавлении образованя бляшек АТ исследуемой сыворотки, оказалась пригодной для серологических исследований при ВД-БС. После получения гомогенного слоя клеток культуру промывают 1 раз фосфатным буферным р-ром и заражают 15 мл суспензии вируса в таком разведении, чтобы в 1 мл ее содержалось около 20 БОЕ. После адсорбции вируса при 37°С в течение 30 мин суши зию отсасывают и наносят на культуру 15 мл агара. После застывания агара на его повед ности раскладывают кружки фильтровальной бумаги, насыщенной неразведенной иссм дуемой сывороткой. После 4 дн инкубации при 37°С учитывают результаты. Доказательством того, что исследуемая сыворотка содержит АТ, служит отсутствие повреждения слоя клеток вокруг насыщенного ею кружка фильтровальной бумаги, что обнаруживается в видевенка клеток.

РСК. Ставят микрометодом с использованием микротитратора Такачи или Титертека. При их отсутствии возможна постановка РСК в пробирках в общем объеме 0,5 мл.

РДП. Не нашла широкого применения в ветеринарной диагностической практике при обнаружении АТ в сыворотках животных. ПА появляются в сравнительно поздние сроки (3-4 нед) после инфицирования и могут сохраняться 4 мес (титры АТ до 1:16).

ЕLISА. В 500 раз чувствительнее РН, менее трудоемок и быстрее выполним. В качесм АГ использовали вирус, концентрированный ПЭГ и очищенный градиентным равновесии ультрацентрифугированием. Оптимальная концентрация АГ составляла 1 мкг на лунку.

Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза на ВД-БС необходимо исключить ИРТ, аденовирусную инфекцию, ПГ-3, злокачественную катаральную лихорадку, ящур, паратуберкулезный энтед и др. Ввиду того, что ВД-БС может проявляться в различных формах (от острой до латентной), часто ассоциируется с такими инфекциями, как ПГ-3, аденоинфекция, хламидиозы др., для окончательного диагноза необходимы лабораторные исследования. Лишь в качесд подозрения на ВД-БС следует учитывать быстрое распространение в стаде болезни, сопровождающейся лихорадкой, диареей, эрозиями в ротовой полости и ранней лейкопенией.