Серологическая идентификация. Подозрительного по заболеванию и больного лейкозом КРС Возраст животных (лет) Число лейкоци­тов у здоровых Абсолютное число лимфо­цитов у

Подозрительного по заболеванию и больного лейкозом КРС

Разработана методика выделения мононуклеарных клеток из периферической крови инфицированного КРС и их культивирования для репродукции инфекционного вируса лейкоза. Метод позволяет получать максимальный сбор инфицированных вирусом лейкоза лимфоцитов. Из 10 мл цельной крови получают пример­но 107 мононуклеарных клеток. Чтобы максимизировать продукцию вирионов и вирусных АГ, к культуре лимфоцитов добавляют Кон-А в конечной концентрации 5 мг/мл.

Конкурентный радиоиммуноанализ (РИА). Наиболее чувствительный метод выявле­ния АГ в культурах лимфоцитов крови инфицированных животных. Метод заключается в том, что экстракт, приготовленный из 48-ч культуры лимфоцитов кро­ви, исследуется на присутствие АГ р24 путем определения его способности предотвращать связывание меченого изотопом р24 со специфическими AT. Для диагностики инфекции ВЛКРС у телят младше 6-мес возраста, которым выпаивали молозиво инфицированных ма­терей, а также у взрослых животных, иммунизированных убитым вирусом или вирусными АГ, необходимо использовать методы, основанные на прямом выявлении инфекционного вируса или вирусных АГ в культурах лимфоцитов крови исследуемых животных.

ПЦР. Дает возможность обнаруживать провирусную ДНК через 2 нед после заражения животных. Для амплификации в ПЦР использовали пары праймеров, соответствующих определенным участкам генов gog 24, env-gp5 или pol вируса лейкоза. Метод позволяет идентифицировать одну копию генома вируса лейкоза на 100000 клеток крови. Сконцентрированные также праймеры для амплификации специфических для вируса лейко­за КРС последовательностей генов pol и рХ. С помощью этого набора праймеров удавалось амплифицировать и выявлять 10 копий ДНК вируса в присутствии в образце 1 мкг хромо­сомной ДНК. Доказана возможность использования нерадиоактивных зондов для выяв­ления вируса лейкоза КРС в лимфоцитах периферической крови и клетках лимфосаркомы. Фрагменты провирусной ДНК метят биотипом. Разработан метод ПЦР с последующей нерадиоактивной блот-гибридизацией для тестирования провируса лейкоза КРС в исследуе­мом материале.

ИФ. Используют прямой и непрямой варианты при исследовании мазков крови и изме­ненных органов, краткосрочных и перевиваемых культур крови и тканей. Непрямой вариант испытывали на концентрате с 80% живых лейкоцитов. В качестве AT применяли сыворотку больной лейкозом коровы и меченную ФИТЦ кроличью сыворотку против глобулинов быка. При микроскопии препаратов отмечена флюоресценция на поверхности лимфоцитов в виде яркого светящегося кольца или кольца из пунктиров. В препаратах из лейкоцитов здоровых животных подобного свечения не наблюдается или оно слабо выражено в некоторых клет­ках. Для объективной оценки препаратов рассчитывается индекс флюоресценции (ИФ) по формуле ИФ = (А - В): А, где А - процент несветящихся клеток в контроле; В - процент не­светящихся клеток в опыте. Положительной считается реакция, если ИФ свыше 0,2; сомни­тельной - 0,11-0,2; отрицательной - ниже 0,1.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. У животных, зараженных ВЛ КРС, вырабатываются AT к вирусным АГ, которые выявляются с помощью серологических реакций. Характерной особенностью инфекции ВЛКРС у КРС является, как правило, по­жизненная персистенция вируса и вирусспецифических AT у больного животного. Поэтому серологические методы обнаружения специфических сывороточных AT являются наиболее практичными, экономичными и широко используемыми в диагностике онковирусной ин­фекции у КРС. Серологическими методами ВЛКРС можно выявлять у животных старше 6 мес, так как у телят, выпаиваемых молозивом и молоком инфицированных ВЛКРС матерей, появляются пассивно приобретенные материнские AT, которые могут персистировать до 6-мес возраста. У зараженных животных в крови циркулируют AT к нескольким структурным белкам вируса. Однако диагностическое значение имеют AT против gp51 и р24 ВБЛ. Количественные соотношения AT анти-р24 и aнти-gp51 могут коррелировать со стадией инфекционного процесса, но при этом, AT к gp51 появляются раньше и содержатся в более высоком титре, чем антитела к р24 и, следовательно, серологические реакции, на­правленные на выявление aнти-gp51 - AT по со своей чувствительности будут превосходить аналоги, в которых используется в качестве АГ р24.

В научно-исследовательских лабораториях для обнаружения специфических AT исполь­зуются РН, подавления раннего и позднего поликариоцитоза, нейтрализации псевдотипов и радиоиммуноанализ (РИА). Однако, для эпизоотологического обследования, контроля и борьбы с ВБЛ-инфекцией широко применяют РИД и ИФА, для постановки кото­рых выпускаются соответствующие коммерческие диагностические наборы. Все вышепере­численные методы предназначены для выявления AT в индивидуальных пробах сыворотки. Для обнаружения AT в низких титрах, например, в индивидуальных пробах молока или в сывороточных пулах, или в образцах, полученных из молочного танка, требуется высокая чувствительность РИА или ИФА. Разработан ряд серологических реакций для диагностики инфекции, таких как РИФ, РСК, РДП в геле, реакция агглютинации латекса (РАЛ), ELISA, РНГА и реакция нейтрализации псевдотипа (РНПТ).

РДП. Благодаря простоте, специфичности и достаточно высокой эффективности эта ре­акция получила наибольшее применение с гликопротеинным АГ ВЛКРС. Из вируса, осаж­денного методом ультрацентрифугирования культуральной жидкости краткосрочных куль­тур лейкоцитов лейкозных животных, очищенного в градиенте плотности сахарозы и обра­ботанного эфиром, получают АГ, который используют в РДП. С помощью этого АГ в сыворотках крови инфицированных ВЛКРС животных выявляют ПА к внутреннему полипептиду вируса р24. РДП с гликопротеидным АГ - более чувствительный метод выявления инфици­рованных ВЛКРС животных, чем РДП с полипептидным АГ. РДП (РИД) в геле агара, на­правленная на выявление aimi-gpSl AT, используется в качестве основного диагностическо­го теста, регламентирующего международную и внутреннюю торговлю племенными живот­ными, спермой и эмбрионами. При первичном обследовании сывороток крови одной РИД считается достаточно для объявления стада свободным от ВБЛ-инфекции. РИД приме­няется в системе противолейкозных мероприятий в неблагополучных хозяйствах.

Специфические ПА к ВЛКРС появляются через 2 мес после инфицирования и сохраня­ются пожизненно. Для постановки РДП используют диагностический набор, в состав кото­рого обязательно должны входить специфический АГ ВЛКРС, специфическая положительная сыворотка крови КРС. Реакцию ставят макро- и микрометодами. Для изготовления АГ используют клеточную линию FLK-BLV. Из культуральной жидкости вирусный АГ выделяют методом преципитации сульфатом аммония или полиэтиленгликолем. Но наиболее технологичным методом выделения вирусного АГ считают ультрафильтрацию на полупроницаемых мембранах. На результат реакции иммунодиффузии влияют многие факторы: ка­чество АГ и контрольных сывороток, количественные соотношения АГ и AT, качество ага-pa, pH и ионная сила буфера, температура, диаметр лунок и расстояние между ними. Для постановки РИД выпускают диагностические наборы: Государственная Курская биофабрика (Россия); PITMAN-MOORE INC., Вашингтон (США), BEHRINGWERKE AG., Марбург (ФРГ), MERIEUX6 Лион (Франция), BIO-VETA NITRAA (Словакия) и др.

Перечисленные диагностикумы представляют собой наборы, состоящие из 2-8 препара­тов. Обязательными компонентами каждого набора являются препараты тест-системы: ви­русный АГ и антисыворотка, которые в результате специфического взаимодействия АГ (gp51 ВБЛ) и AT в процессе диффузии формируют в геле агара нерастворимый комплекс в виде опалесцирующей полосы. Дополнительно наборы могут комплектоваться сухой соле­вой смесью агара, стерильным разбавителем для вирусного АГ и контрольными сыворотка­ми, которые поставляются в жидком или лиофилизированном виде. В последнем случае на­боры комплектуют соответствующими разбавителями контрольных сывороток. Наборы рас­считаны на 90-500 исследований и содержат 3-5 мл вирусного АГ.

РИД проходит в 0,8-1,0% геле агара, который готовят на трис-HCl или боратном буфе­рах в диапазоне рН 7,2-8,6, содержащим 8-8,5% NaCl. Методика постановки реакции оди­наковая для всех диагностикумов и предусматривает заполнение лунок АГ, антисывороткой и испытуемыми сыворотками по схеме 1:2:4 или 1:3:3. Принято 2 стандарта на диаметр лу­нок и расстояние между ними: 1 вариант в странах ЕЭС, тогда как в США, Канаде и стра­нах СНГ приняты параметры, соответствующие второму варианту.