Субстрат может быть ингибитором фермента

Торможение продуктом реакции- пример конкурентного торможения.

Заключительный этап в действии любого фермента -выделение продукта. Это важный этап в работе фермента. Продукт связан с активным центром теми же связями, которые связывали и субстрат. Это взаимодействие похоже на субстрат связывающую реакцию, и подобно этой реакции, чаще всего является очень быстрой и легко обратимой. В результате этого, молекулы продукта способны к связыванию со свободным ферментом, образуя комплекс продукта и фермента. Как и в случае действия конкурентного ингибитора, продукт и субстрат пытаются занять активный центр, но не могут связываться одновременно. Поэтому предшествующее связывание продукта предохраняет фермент от связывания с субстратом, и продукт эффективно действует как ингибитор. В ферменте, катализирующем реакцию первого порядка это специализированная форма конкурентного торможения, поскольку субстрат и продукт конкурируют друг с другом. В ферментах с больше чем одним субстратом это выглядит более сложно.

В ферментных кинетических исследованиях мы почти всегда изучаем начальные скорости, которые является скоростью реакции, начинающейся немедленно после добавления фермента к субстрату. В это период времени, конечно, продукта нет, поскольку он еще не успел возникнуть, так что мы обычно игнорируем торможение продуктом в наших кинетических исследованиях.

Обычно увеличение концентрации субстрата увеличивает скорость реакции фермента. Однако на некоторые ферменты большие количества субстрата могут оказывать противоположный эффект и фактически замедлять реакцию. Примером может служить инвертаза или - фруктофуранозидаза (КФ.3.2.1.26), который катализирует реакцию гидролиза

Рис 2-13. Влияние концентрации субстрата на скорость реакции

сахарозы на составляющие моносахариды глюкозу и фруктозу.

Предполагают, что причиной торможения может быть попытка двух молекул субстрата одновременно связаться с активным центром и пока молекулы субстрата связаны с активным центром фермент неактивен. Для такого связывания необходимо, чтобы вторая молекула субстрата «вставилась» в активный центр быстро вслед за первой, пока последняя не успела занять полноценную позицию для катализа. Поскольку столкновения между ферментом и субстратом полностью случайны, такое может случиться только при высоких концентрациях субстрата, когда частота случайных столкновений увеличивается, и явление торможения может быть замечено исследователем. Пример такого влияния показан на рис 2-13.

Так как торможение субстратом происходит при высоком уровне субстрата, начальная часть (низкая концентрация субстрата) этого графика идентична таковой для нормального

Рис 2-14. График Лаинуивера-Берка по данным рис 2-13.

фермента. При высоком уровне субстрата кривая снижается, что свидетельствует о торможении скорости реакции.

Так как фермент не следует предписаниям уравнения Михаэлиса и Ментен (не прямоугольная гипербола), график Лайнуивера Берка также не линеен. Поэтому вблизи оси 1/V на участке высокой концентрации субстрата, линия изгибается вверх, указывая на снижение скорости. Продолжая линейную часть графика до пересечения с осями можно определить основные кинетические параметры обычным способом.

Табл 2- 5. Эффекты обратимых ингибиторов на кинетические константы

Тип ингибитора	Эффект
Конкурентный (I связывается только к E)	Увеличение Km, а Vmax остается без изменений
Неконкурентный (I связывается только с ES)	Снижена Vmax и Km Отношение Vmax.Km остается без изменений
Смешанный неконкурентный (I связывается с E или ES)	Снижается Vmax. Km остается без изменений