Определение N-концевой АК

УСТАНОВЛЕНИЕ АК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ БЕЛКА

Анализ гомологичных белков

Аффинная хроматография

Двухмерный электрофорез

Изоэлектрофокусирование

Выделение индивидуальных белков

Метод основан на различной величине ИЭТ белков. Белки разделяют методом электрофореза на пластине с амфолином (это вещество, которое формирует градиент pH в диапазоне от 3 до 10). При электрофорезе белки разделяются в соответствии со значением их ИЭТ (в ИЭТ заряд белка будет равен нулю, и он не будет передвигаться в электрическом поле).

Представляет собой сочетание изоэлектрофокусирования и электрофореза с ДДС-Na. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении на пластине с амфолином. Белки разделяются в зависимости от заряда. Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.

Метод основан на способности белков связываться со своими лигандами. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.

Колонку для аффинной хроматографии заполняют инертным веществом, к которому ковалентно присоединены лиганды (молекулы, с которыми специфически будут связываться определенные белки). При прохождении смеси белков через колонку искомый белок присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Белок, который остался в колонке, затем можно выделить с помощью буферного раствора, содержащего лиганд в свободном состоянии. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.

Гомологичные белки — белки, которые выполняют одну и ту же функцию, но различаются по первичной структуре (например, локализованы в различных органах или образуются при патологических состояниях). Например, HbA (содержит Glu) Þ HbS (содержит Val) при серповидноклеточной анемии.

Метод пептидных карт (отпечатков пальцев),предложенный Ингремом

Этапы:

1) оба анализируемых белка расщепляют на фрагменты (пептиды);

2) смесь пептидов каждого белка наносят в виде пятна на угол листа хроматографической бумаги;

3) проводят электрофорез в горизонтальном направлении;

4) проводят распределительную хроматографию в вертикальном направлении;

5) полученные карты окрашивают и сравнивают;

6) различающиеся пептидные пятна выделяют и анализируют.

1. Метод Сэнджера (ФДНБ — фтординитробензол — связывается с N-концевой АК с образованием соединения желтого цвета).

2. Метод Эдмана (используется ФИТЦ — фенилизотиоцианат, который также связывается с N-концевой АК с образованием соединения оранжевого цвета).

3. Дансилирование (взаимодействие N-концевой АК с дансилхлоридом с образованием флуоресцирующего соединения).

4. Ферментативный метод (использование аминопептидаз — это ферменты, которые избирательно отщепляют N-концевые АК, например, аланиновая аминопептидаза).