Шапероны

3.5.3.1. Функции шаперонов

Функции, приписываемые шаперонам, весьма широки.

1) Прежде всего, это, обеспечение правильного фолдинга новообразованных белков.

В данной функции есть несколько аспектов.

а) Так, до того, как большинство гидрофобных аминокислотных радикалов уйдет внутрь белковой частицы, они могут вступить во взаимодействие с аналогичными радикалами других пептидных цепей. Иначе говоря, до окончания фолдинга
возможна агрегация новосинтезированных белковых молекул. Такая агрегация, если произойдет, воспрепятствует дальнейшему фолдингу этих молекул и создаст ненужный балласт в клетке.

Предупреждение агрегации новых белков, т. е. предупреж­дение «неправильных» внешних взаимодействий в ходе фолдинга — одна из важнейших задач шаперонов.

б) Другая сопряженная задача — предупреждение «неправильных внутренних (в пределах одной пептидной цепи) взаимодействий.

в) Третий аспект той же функции — лабилизация «неправильных» слабых связей (если они все-таки образовались), с тем, чтобы пептидная цепь не оказалась зафиксированной в «неправильной» конформации, а могла достичь наиболее оптимальной формы. В отличие от фолдаз речь идет о лабилизации не ковалентных, а слабых связей.

Все вместе это и означает «обеспечение правильного фолдинга.

2) Следующая функция шаперонов — контроль за рефолдингом. Имеется в виду, что под действием самых разных причин (перегрева, облучения, действия оксидантов и т. д.) белки, относительно давно синтезированные и до того успешно функционировавшие, могут терять свою нативную конформацию, частично или полностью денатурировать, что, сопровождается склонностью к агрегации.

Такие белки в клетке могут подвергаться рефолдингу (или ренатурации) при активной помощи шаперонов.

Показано, что, если бактериальная клетка относительно долго пребывает в стрессовых условиях, например, их при температуре 42^о С, то это приводит к резкому увеличению т. н. белков теплового шока, которые являются ничем иным как шаперонами.

Аналогичный эффект наблюдается и у эукариот. Поэтому у тех и у других шапероны часто обозначаются буквами Нsр (от английского, heat shock proteins - белки теплового шока).

3) Третья функция шаперонов – участие в некоторых видах виутриклеточного

транспорта белков: в частности, в лизосомы (для белков, «отслуживших» свой срок и не поддающихся рефолдингу) и в митохондрии.

В митохондрии переносятся, напротив, новосинтезированные белки. Фолдинг этих белков откладывается до того момента, пока они не окажутся внутри митохондрий.

Это объясняется тем, что пептидной цепи легче проникнуть через липидные слои мембран, если она находится в развернутом состоянии. Шапероны, те, которые находятся вне митохондрий, связываются с продуктами трансляции и поддерживают их в развернутом состоянии до контакта с мтх мембранами. Т.е. эти шапероны предупреждают преждевременный фолдинг. Другие шапероны, находящиеся внутри мтх, принимают поступившие пептидные цепи и помогают им принять нативную форму.

4) Четвертая функция – поддержание ряда белков в опре­деленной конформации, в состоянии как бы незавершенного фолдинга. В этом случае, очевидно, шапероны не теряют связи с соответствующим белком после его сворачивания.

Пример — содержащиеся в ядре рецепторы к стероидным гормонам — эстрогенам и прогестерону. Эти белки связаны с шаперонами (Hsp). Но незавершен­ность фолдинга приводит к неспособности связываться с ДНК. Присоединение соответствующего гормона вы­зывает диссоциацию шаперонов, изменение структуры рецепто­ра и связывание последнего с нужным локусом ДНК.

Механизмы действия шаперонов.

Рассмотрим некоторые наиболее изученные системы, от­ветственные за выполнение, по крайней мере, двух первых из вышеперечисленных функций, т. е. за фолдинг новообразован­ных и рефолдинг поврежденных белков.

Система DnaK/ DnaJ у бактерий.
Белки теплового шока часто обозначаются по их молекулярной массе. Например, семейство белков Hsp70 — это шапероны с массой около 70 кДа.

У шаперонов чисто имеются « помощники», или ко-шапероны. Это тоже белки, но обычно с меньшей молекулярной массой.

Один из представителей Нsр70 — шаперон DnaK; его ко-шапероном является белок DnaJ.

Система этих белков осуществляет, видимо, ко-трансляционный фолдинг (рис. 3.23). Иначе говоря, они связываются с синтезирующимися полипептидными цепями еще до окончания трансляции, когда эти цепи еще находятся на рибосомах.
Такое раннее связывание предупреждает «неправильные» взаимодействия внутри незавершенных пептидов и агрегацию цепей, высвобождающихся с рибосом.

В процессе фолдинга неоднократно расходуется АТФ. А по окончании фолдинга для отделения шаперонов требуется еще один фактор GrpE.

Если после этого белок еще не принял окончательной нативной конформации, то на его поверхности остаются радикалы, способные связывать шапероны DnaK/DnaJ повторно. И так далее: полагают, что может быть несколько циклов связы­вания и высвобождения этой системы.

У Е. coli примерно 200 - 300 белков (составляющие 5 - 10 % от общего белкового пула) и после неоднократной «обработки» системой DnaK / DnaJ остаются в состоянии неза­вершенного фолдинга в виде расплавленной глобулы. Т. е. у них практически сформирована нативная вторичная структура, но межрадикальные связи являются пока случайными и не­прочными (п. 3.4.3.1). В основном, к таким белкам относятся достаточно крупные белки с относительно сложной простран­ственной конфигурацией.

Завершение фолдинга таких белков происходит с помощью другой системы шаперонов — GroEL/GroES.

3.5.3.3. Система GroEL/GroES у бактерий

Эта шаперонная система изучено особенно хорошо. Шаперон GroEL относится к белкам Hsp60, т. е. имеет массу около 60 кДа (а точнее, 57 кДа). Масса ко-шаперона GroES существен­но меньше — 10 кДа.

Нередко белки Hsp60 называют не шаперонами, а шаперонинами. Соответственно, и рассматриваемая здесь система GroEL/GroES тоже называется шаперониновой.

Эта система (как и все семейство Нsр 60) содержится в бактериальных клетках, а также в митохондриях и хлоропластах эукариот. (Еще один признак, сближающий эти органеллы с прокариотами; п. 3.2.4.2.)

Система особенно интересна тем, что ее белки формируют уникальный комплекс (рис. 3.24). Он имеет вид двух «котлов», прилежащих друг к другу днищами, причем один из них (и только один!) может быть зак­рыт «крышкой».

Стенки и дно каждого «котла» образованы 7 молекулами (субъединицами) белка СroEL, расположенными по окружности.

В составе каждой субъедини­цы этого белка — три домена (рис. 3.25):

-апикальный (находится в области отверстия «котла»),

-промежуточный (участвует в образовании стенки «котла») и

-экваториальный (вместе с аналогичными доменами других субъединиц формирует дно «котла» и обеспечивает связь между двумя «котлами»).

Отверстие «котла» несколько уже, чем остальная часть его поло­сти. В центральной же части по­лость имеет диаметр 9 нм, что впол­не достаточно для размещения в ней весьма крупного белка. Всего в клетке Е. colti - примерно 700 подобных комплек­сов белка GroEL (содержащих по 14 субъединиц).

Что же касается «крышки», которой может быть закрыт один из «котлов», то ее формируют 7 субъединиц второго бел­ка — ко-шаперонина GroES.

При этом имеется принципиальное обстоятельство: связы­вание «крышки» меняет конфигурацию белка GroEL. В откры­том «котле» конфигурация такова, что на внутренней поверхно­сти полости преобладают гидрофобные радикалы. В закрытом же «котле» внутренняя поверхность является гидрофильной (из-за переориентации соответствующих радикалов).

Эти изменения конфигурации энергетически обеспечива­ются гидролизом АТФ. И для диссоциации «крышки», и для ее связывания должен происходить распад 7 молекул АТФ (до АДФ и фосфата). Катализируют этот распад сами субъединицы белка GroEL — по 1 молекуле АТФ на субъединицу за каждый акт диссоциации или связывания «крышки» и сопутствующего изменения конформации.

Предполагаемый механизм функционирования данной системы показан на рис. 3.26.

В исходном состоянии комплекса полости обоих «котлов» пусты, а отверстие одного из них закрыто «крышкой». Дальнейшие события таковы.

а) В открытый «котел» проникает субстрат — как мы уже говорили, это белок в состоянии незавершенного фолдинга, а именно расплавленная глобула.

Связыванию способствует тот факт, что на поверхности и такой глобулы, и внутренней стенки открытого «котла» в из­бытке находятся гидрофобные радикалы.

Некоторые авторы считают, что в процессе этого связыва­ния апикальные домены белка GrоEL могут также физически разворачивать глобулу, если она имеет «неправильную» структуру. Это позволяет объяснить вторую функцию шаперонов — рефолдинг давно образованных, но частично денатурированных белков.

б) Взаимодействие субстрата с «котлом» инициирует диссоциацию «крышки» от второго «котла». Соответственно, происходит гидролиз 7 молекул АТФ, и второй «котел» также становится гидрофобным.

Не вполне ясно: может ли он теперь тоже связать молекулу белка с незавершенной структурой? Возможно, при занятом первом «котле» этому мешает какое-либо стерическое препятствие (тоже обусловленное изменением конформации белка GroEL).

в) Диссоциировавшая «крышка» тут же связывается вновь – с равной вероятностью с одним из двух «котлов». Следовательно, в 50% случаев она закрывает тот «котел», который содержит белок.

В таком случае срабатывают два обстоятельства.

Во-первых, белок оказывается в замкнутом пространстве и, следовательно, теряет способность к агрегации с себе подобны­ми частицами.

Во-вторых, в данном «котле» внутренняя поверхность ста­новится гидрофильной. Поэтому белок теряет связь с нею и оказывается предоставленным в полости сам себе.

В этом, как полагают, и состоит ключевая роль данной системы: она просто изолирует сворачивающийся белок, предва­рительно устраняя в нем «неправильные» взаимодействия, и затем дает ему возможность самому найти оптимальную пространственную структуру.

г) Через 15–20 сек происходит очередной гидролиз АТФ —
«крышка» диссоциирует и «котел» опять становится гидро-
фобным.

Если за это время белок успел принять нативную конформацию (т. е. сделался с поверхности гидрофильным), он больше не «липнет» к стенкам полости и диффундирует из нее.

д) Если же фолдинг не завершился, белковая глобула
вновь связывается со стенками, оставаясь в полости.

Тогда после очередного связывания «крышки» цикл повторяется снова. И так далее - пока не будет достигнут необходи­мый результат.

В частности, для одного из ферментов — роданезы — уста­новлено: его фолдинг в системе GroEL/GroES включает в сред­нем 7 циклов.

Очевидно, все эти циклы могут проходить только по окончании трансляции.

Если белок является олигомерным, то роль системы GroEL/GroES состоит в том, что она обеспечивает правильный фолдинг отдельных субъединиц и затем поставляет их в готовом ви­де в цитозоль. Сама же сборка субъединиц в олигомерные струк­туры происходит вне полостей данной системы.