Культивирование и рост микроорганизмов

Структура клеток микроорганизмов. Функционирование клетки как системы. Механизмы энергетического обмена клетки. Условия роста микроорганизмов. Физиология роста микроорганизмов. Типы питания микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов.

Вода является той необходимой средой, в которой только и могут осуществляться все эти химические реакции, с водой же удаляются из клетки продукты обмена.

Часть воды в клетке находится в связанном состоянии с белками, углеводами и другими веществами и входит в клеточные структуры. Остальная вода находится в свободном состоянии и служит дисперсной средой для коллоидов и растворителем различных органических и минеральных соединений, образующихся в клетке при обмене веществ. Содержание свободной воды в клетке изменяется в зависимости от условий внешней среды, физиологического состояния клетки, ее возраста и др. Так, в спорах бактерий и грибов значительно меньше воды, чем в вегетативных клетках. Потеря свободной воды приводит к высыханию клетки и изменению обмена веществ. Потеря связанной воды приводит к нарушению клеточных структур и гибели клетки.

Сухая биомасса клетки — это в основном полимеры.

Белки. Содержание белков в клетке составляет около 50 %. У разных микроорганизмов содержание белков следующее (%): у бактерий 40...80, у дрожжей 40...60, у грибов 15...40. Белки выполняют две основные функции: во-первых, входят в состав всех мембран клетки; во-вторых, играют роль ферментов — биохимических катализаторов, которые обусловливают, направляют и ускоряют почти все химические реакции, происходящие в

живой клетке. Среди белков есть и такие, которые убивают жизнь, — токсины. Бактериальные токсины наиболее ядовитые. Некоторые микроорганизмы синтезируют большое количество белков в клетке — до 80 %. Такие микроорганизмы рассматриваются

как возможные продуценты кормового и пищевого белка. Промышленное производство таких белков рентабельно, так как микроорганизмы быстро растут независимо от времени года и погоды. В качестве сырья для их роста используются отходы пищевой и других отраслей промышленности. Продуцентами могут быть дрожжи, бактерии и водоросли, особенно цианобактерии.

Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК). В клетке содержится от 3 до 4 % ДНК и от 10 до 20 % РНК. В молекуле ДНК закодирована вся наследственная информация вида. ДНК сосредоточена в основном в ядре эвкариотной клетки и в нуклеоиде прокариотной клетки. Часть ДНК находится в плазмидах. РНК сосредоточена главным образом в рибосомах (до 80%), синтезирующих белок, и в цитоплазме.

Липиды. В клетке образуется до 10 % липидов. Некоторые дрожжи и плесневые грибы синтезируют до 40... 60 % липидов. Липиды входят в состав цитоплазматической мембраны и в состав мембран. Могут находиться в цитоплазме в виде гранул.

Клеточная стенка. Клеточная стенка обусловливает целостность клетки и составляет до 20 %. Пигменты и минеральные вещества. Клетки микроорганизмов содержат в небольших количествах пигменты и минеральные вещества. Пигменты обусловливают окраску микроорганизмов, некоторые из них выделяются в окружающую среду. Фотосинтезирующие бактерии образуют пигмент бактериохлорофилл. Фототрофные микроорганизмы и отдельные виды дрожжей образуют каротиноиды, некоторые из которых являются провитамином витамина А. Микроорганизмы, синтезирующие такие пигменты, являются перспективными продуцентами белково-витаминных кормов.

Минеральные вещества (элементы) составляют не более 5 %. Из них 50 % принадлежит углероду; 20 — кислороду; 10 — водороду; 10... 15 — азоту; 2... 6 % — фосфору. Другие элементы содержатся в еще меньших количествах: сера — 1 %; калий — 1; кальций — 0,5; магний — 0,5; железо — 0,2 % и др. Минеральные соединения играют большую роль в регуляции внутриклеточного осмотического давления и коллоидного состояния цитоплазмы. Они влияют на скорость и направление биохимических реакций, являются стимуляторами роста, активаторами ферментов.

Функционирование клетки как системы Клетка может быть рассмотрена как система, состоящая из четырех подсистем: геном клетки с хромосомой, аппаратом репликации (репликсомой) и РНК-полимеразой; рибосома — аппарат синтеза белка; цитоплазма (цитозоль), которая включает в себя сеть метаболических путей с обслуживающими их ферментами; мембрана с энергодающим аппаратом синтеза АТФ и транспортными системами, осуществляющими взаимодействие клетки с окружающей ее средой.

Геном клетки. Геном клетки представляет собой постоянную для вида компоненту и может быть оценен анализом ДНК. Установлена последовательность оснований ДНК, соответствующих многим отдельным генам. Хромосома содержит: генетическую информацию вида; генетическую информацию для собственной репликации за счет предшественников (азотистых оснований), поступающих из цитоплазмы, и энергии, поступающей от энергодающего мембранного аппарата; информацию для синтеза белка РНК-полимеразным блоком в соответствии с регуляторными сигналами в виде белков — активаторов и репрессоров, поступающих из цитоплазмы.

Рибосома. Рибосома представляет собой РНК-содержащий аппарат синтеза белка из аминокислот-предшественников, поступающих из цитоплазмы и расходующих энергию, поступающую от энергодающего мембранного материала. Рибосома действует в соответствии с командами, получаемыми через РНК-полимеразу от хромосомы. Рибосома оценивается по суммарному содержанию РНК в клетке. В покоящейся клетке РНК мало, но по мере активизации роста клетки содержание ее увеличивается.

Цитоплазма клетки. Цитоплазма представляет собой прежде всего «котел» метаболических превращений веществ, поступающих извне, с образованием энергетических субстратов для АТФ-продуцирующего блока (энергетический обмен, или катаболизм) и соединений-предшественников для синтеза компонентов клетки (конструктивный обмен, или анаболизм).

Катаболизм и анаболизм в той или иной степени сопряжены, общую их часть называют амфиболизмом, или центральным метаболизмом. Среди процессов центрального метаболизма, которые осуществляют микроорганизмы, первостепенное значение имеет разложение углеводов (глюкозы). Наиболее распространенным является процесс Эмбдена—Мейергофа, или гликолиз, в котором при окислении одной молекулы глюкозы образуются в конечном итоге две молекулы пирувата, две молекулы АТФ и две молекулы восстановителя НАДН. Такой процесс характерен для многих анаэробных органотрофных

сахаролитических организмов, осуществляющих брожение углеводов. Гликолиз проходит в несколько этапов. На первом этапе глюкоза в клетке фосфорилируется с участием фермента гексокиназы и АТФ в качестве донора фосфата и переходит в глюкозо-6-фосфат. На втором этапе глюкозо-6-фосфат изомеризуется ферментом фосфоглюкоизомеразой до фруктозо-б-фосфата. На третьем этапе происходит фосфорилирование фруктозо-бфосфата под действием фермента фосфофруктокиназы за счет АТФ и перехода во фруктозе-1,6-дифосфат. На четвертом этапе фруктозо-6-дифосфат расщепляется ферментом альдолазой до диоксиацетонфосфата и 3-фосфоглицеринового

альдегида, которые находятся в равновесии, катализируемом ферментом триозофосфатизомеразой. Дальше диоксиацетонфосфат превращается в глицерин. Дальнейшему расщеплению подвергаются две молекулы 3-фосфоглицеринового альдегида. На пятом этапе происходит окисление 3-фосфоглицеринового альдегида под действием фермента триозофосфатдегидрогеназы до 1,3-дифосфоглицериновой кислоты, в которой сохраняется энергия, освободившаяся при окислении фосфоглицеринового альдегида. На шестом этапе фосфатная группа 1,3-дифосфоглицериновой кислоты при участии фермента фосфоглицераткиназы переносится на молекулу аденозиндифосфорной кислоты с образованием 3-фосфоглицериновой кислоты, а АДФ превращается в АТФ. На седьмом этапе 3-фосфоглицериновая кислота под действием фермента фосфоглицеромутазы переходит в 2-фосфоглицериновую кислоту. На восьмом этапе 2-фосфоглицериновая кислота под действием фермента энолазы, теряя воду, переходит в фосфоэнолпируват (фосфопировиноградная кислота). На девятом этапе фосфоэнолпируват под действием фермента пируваткиназы дефосфорилируется, при этом богатая энергией фосфатная группа передается на молекулу АДФ, которая превращается

в АТФ, и образуется пируват (пировиноградная кислота).

Большинство углеродных скелетов аминокислот для синтеза белков поставляет ЦТК. Для синтеза 20 аминокислот достаточно всего шесть исходных метаболитов. В результате других процессов центрального метаболизма образуются пурины, пиримидины, липиды, фосфолипиды, углеводы и другие компоненты клетки, составляющие сложную транспортную сеть веществ.

Цитоплазма является местом действия ферментов. В цитоплазме же находятся компоненты сигнальных путей. Изучение цитоплазматического «котла» привело к созданию метаболических карт, представляющих собой сеть транспортных путей, аналогичную сети промышленного производства.

Помимо более или менее сходного для всех микроорганизмов центрального метаболизма (с циклом трикарбоновых кислот и образованием предшественников аминокислот) существует и подготовительный метаболизм, различный у разных организмов и служащий

для совмещения разнообразных используемых субстратов с реакциями центрального метаболизма. У некоторых организмов реакции катаболизма и анаболизма представляют собой два отдельных потока. Процесс центрального метаболизма — существенная часть биохимии микроорганизмов. Метаболизм бактерий является важнейшей характеристикой их функционального разнообразия.

Мембрана с энергодающим аппаратом. Мембрана с энергодающим аппаратом осуществляет электрохимическое преобразование энергии во внутреннюю энергию мембраны и синтез АТФ. В мембране расположен механизм трансмембранного переноса

исществ: субстратов — внутрь клетки, а продуктов обмена — наружу. Система транспорта определяет сродство клетки к субстратам метаболизма и эффективность осуществляемых ею химических реакций. Об активности энергетического обмена клетки судят по «энергетическому заряду», который соответствует относительному содержанию АТФ и энергизации мембраны. Таким образом, клетка представляет собой систему, все подсистемы которой взаимосвязаны, хотя и индивидуальны.

Механизмы энергетического обмена клетки Энергетический обмен клетки направлен на поддержание и умножение веществ, из которых состоит клетка, и удаление из клетки продуктов обмена. При изучении механизмов энергетического обмена необходимо иметь представление об источниках энергии, механизме поступления питательных веществ в клетку, а также о ферментах, с помощью которых происходят реакции обмена.

Источники энергии. Источниками энергии для организмов могут служить энергия света и энергии окислительно-восстановительных реакций (химическая энеря). При этом если энергию света могут использовать только фосинтезирующие микроорганизмы, то способность использо:ватшмическую энергию присуща всем без исключения организмам, особенно многообразны возможности прокариот.

Окислительно-восстановительнъреакции представляют собой перенос электронов от окисляе мо вещества (донора электронов) к окислителю (акцептору).Перенос электронов от донора акцептору осуществляется через ряд последовательно функционрующих переносчиков. Часть переносчиков закреплена в мембрана, а часть находится в цитоплазме

и сопрягает эти два комплекса клетки. Набор переносчиков характера для каждого организма. Комплекс переносчиков электронов работает как универсальная структура для всех окисляемых веществ лишь бы в метаболизме была реакция, конечным продуктом котой является АТФ — важнейший, но не единственный переносчик энергии в клетке.

Первый механизм синтеза АТС- субстратное фосфорилирование, чаще всего за счет перешофосфорильной группы от богатого энергией соединения на -АД1 Этот способ реализуется при гликолизе, разнообразных брожении других процессах. Субстратное фосфорилирование осуществлятся в цитоплазме и может быть воспроизведено в бесклеточных экстрактах.

Второй механизм синтеза АТФ- мембранное фосфорилирование. Он зависит от наличия энерзованной мембраны и связан с использованием энергии трансмембранного электрохимического градиента ионов, чаще всего ионов водорода. Этот механизм реализуется в процессах дыхании окислительного фосфорилирования) и фотосинтеза (фотофо сфилирования). Концентрация АТФ в клетке определяет ее энергетический заряд.

Максимальный энергетически заряд достигается в период интенсивно идущего катаболизма минимального потребления на анаболизм, но в общем поддерживается в клетке примерно постоянным. Поступление питательных веществ в клетку. Поступление питательных веществ (молекул) в клетку из среды и выделение продуктов обмена определяет взаимодействие клетки со средой. За поступление питательных веидес'в клетку отвечает мембрана которая селективно (избирателе пропускает не все вещества, а только те, которые необходимы данный момент. Некоторые молекулы поступаю клетку путем пассивной диффузии до выравнивания конце нити. Пассивно проходят через мембрану кислород, вода, а так жиры и жирные кислоты.

Пассивная диффузия важна и для удаления из клетки продуктов обмена. Скорость диффузии может быть увеличена за счет механизма облегченной диффузии, в котором участвуют пермеазы — пересекающие мембрану белки-переносчики. Они связываются с транспортируемым веществом, претерпевают конформационные изменения, в результате чего вещество переносится через мембрану в область его более низкой концентрации. Облегченная диффузия ускоряет процесс выравнивания концентраций, но не может привести к концентрированию вещества внутри клетки. Это может сделать только активный транспорт веществ через мембрану, осуществляемый трансмембранными белками. Трансмембранные белки представляют собой важнейшее приспособление клетки для взаимодействия с окружающей средой. Они осуществляют не только перенос молекул через мембрану, но и активный транспорт, который позволяет избирательно концентрировать внутри клетки необходимые ей вещества против градиента, осуществляя специфическую химическую реакцию. Активный транспорт осуществляется с затратой энергии либо АТФ, либо за счет энергизованной мембраны. От активного транспорта зависит сродство (аффинность) клетки к субстрату, а это важнейший признак, определяющий и набор, и концентрацию используемых веществ. Особо надо отметить, что клетки обладают разными системами транспорта вещества, которые включаются в зависимости от высокой или низкой концентрации субстрата.

Ферменты микроорганизмов. Все реакции обмена веществ в клетке осуществляются с помощью ферментов — биологических катализаторов, которые клетка сама же и синтезирует по мере надобности.

Ферменты, состоящие только из белковой молекулы (однокомпонентные), называются протеинами. Ферменты, состоящие из белковой молекулы и небелкового компонента (простетической группы), называются протеидами. Ферменты, которые всегда есть в клетках данного вида микроорганизмов, называются конститутивными. Ферменты, которые синтезируются только при наличии в среде нового субстрата, называются индуцируемыми, или адаптивными. В живой клетке все процессы происходят упорядочение и строго о согласованно. Ферменты в клетке локализованы в мезосомах, цитоплазматической мембране, на всех других мембранах. Некоторые ферменты выделяются микроорганизмами в среду. Такие ферменты называют экзоферментами. Они осуществляют подгонку веществ для поступления в клетку: расщепляют крахмал, (юлки и другие вещества на более простые, способные пройти через поры клеточной стенки. Ферменты, которые не выделяются при жизни в среду, называются эндоферментами. Эндоферменты участвуют во внутриклеточных процессах обмена веществ. После гибели микробной клетки ее ферменты остаются какое-то время в активном состоянии и могут привести клетку к автолизу (от гр. autos — сам, lysis — растворение) — саморастворению,

или самоперевариванию, клетки под влиянием внутриклеточных ферментов. При разрушении клеток ферменты поступают в среду, в которой развивались микроорганизмы. При хранении пищевых продуктов с большим числом клеток микроорганизмов в условиях, исключающих развитие этих микроорганизмов, возможно снижение качества продуктов за счет ферментов автолизированных микробных клеток.

Классификация ферментов. К настоящему времени выделено и изучено около 1000 ферментов в чистом виде. Все они подразделены по правилам номенклатуры ферментов а шесть классов: 1-й класс — оксидоредуктазы, или окислительно-восстановительные ферменты, которые переносят водород или электроны и катализируют биологическое окисление, осуществляя гидрогенизацию и дегидрогенизацию;

2-й класс — трансферазы, которые переносят группы атомов с помощью специфических переносчиков, действующих как коферменты. Они играют активную роль в биохимических превращениях и могут переносить метальные, карбоксильные, аминосульфогруппы, формильные (С,) или фосфорильные группы;

3-й класс — гидролазы, которые катализируют гидролитическое расщепление и в зависимости от типа разрываемой связи называются: мальтаза (расщепляет мальтозу на две молекулы глюкозы); сахараза (расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу); лактаза (расщепляет молочный сахар на галактозу и глюкозу); амилаза (расщепляет крахмал); целлюлаза (расщепляет целлюлозу, или клетчатку, с образованием дисахарида целлобиозы, которая в дальнейшем расщепляется на две молекулы глюкозы; образуется грибами и некоторыми бактериями); пектолитические ферменты (комплекс ферментов, гидролизующих пектиновые вещества). Пектиновые вещества в виде нерастворимого протопектина находятся в растениях в качестве межклеточного вещества и входят в состав клеточных стенок. При участии пектолитических ферментов (протопектиназы, пектинэстеразы, полигалактуроназы) протопектин и растворимый пектин гидролизуются с образованием метилового спирта, галактуроновых кислот, пентоз и гексоз. Пектолитические ферменты синтезируют многие плесневые грибы и некоторые бактерии.

Развитие этих микроорганизмов в растительном пищевом сырье (плодах и овощах) приводит к мацерации (размягчению) тканей сырья; пептидазы, или протеолитические ферменты (катализируют гидролиз белков, пептидов, расщепляя пептидные связи; обладают специфичностью, разрывая пептидные связи между определенными аминокислотами); дезаминазы и амидазы (катализируют гидролитическое расщепление

аминокислот и амидов с отщеплением азота в виде аммиака); эстеразы (катализируют реакции расщепления и синтеза сложных эфиров; широко распространены у микроорганизмов; к ним относятся липазы, которые гидролизуют жир, и фосфатазы, расщепляющие эфироподобные фосфорсодержащие органические соединения с освобождением фосфорной кислоты); 4-й класс — лиазы (отщепляют группы,СО2, Н2О, NH3 и др. от молекулы субстрата негидролитически). К этому классу относятся: альдолаза — фермент, который участвует в начальной стадии превращения сахара в процессе дыхания и брожения; декарбоксилазы (катализируют декарбоксилирование, или отщепление, СО2, органических кислот, аминокислот; в последнем случае образуются амины). Микроорганизмы, особенно гнилостные бактерии, богаты декарбоксилазами аминокислот; 5-й класс — изомеразы, которые катализируют превращения изомеров, включая рацемизацию, цис-транс-изомеризацию, перемещение двойных связей, обмен групп у асимметричного атома углерода, перемещение фосфатной группы к другому атому углерода; 6-й класс — лигазы (катализируют реакции синтеза сложных органических соединений из более простых; реакции идут с затратой энергии, получаемой из АТФ). К лигазам относятся глутаминсинтетаза и аспарагинсинтетаза. Лигазы играют большую роль в углеводном и азотном обмене микроорганизмов.

Применение ферментов. Применение в пищевой и легкой промышленности ферментов, полученных из микроорганизмов, позволяет значительно интенсифицировать технологический процесс, повышает выход и улучшает качество готовой продукции.

Получение ферментов из микроорганизмов гораздо дешевле, чем из животного и растительного сырья, так как микроорганизмы: обладают очень богатым набором ферментов. Среди них есть даже такие, каких нет у животных и растений; быстро размножаются и в течение короткого времени дают огромную массу клеток, из которых можно выделить большое количество ферментов. Некоторые ферменты получают из культуральной жидкости (среды); выращивают на дешевых средах, являющихся, как правило, отходам и различных пищевых производств; выращивают в специальных ферментерах, в которых удобно управлять всем процессом. Продуцентами ферментов являются грибы, бактерии, дрожжи. Ферменты получают разной степени очистки. Самые чистые ферменты использvют в медицине, нативные — в кормопроизводстве.

Аминолитические грибные ферменты применяют в производстве этилового спирта из крахмалсодержащего сырья вместо зернового солода, в мюбопекарной промышленности — вместо солода при изготовлении заварного ржаного хлеба, добавляют амилазы и в пшеничное тесто. В результате ускоряется процесс изготовления теста: увеличивается объем и пористость хлеба, улучшается его внешний вид, аромат и вкус.

Применение амилаз в пивоварении позволяет частично заменить солод несоложеным (непророщенным) ячменем. Грибная глюкоамилаза дает возможность получать глюкозную патоку и кристаллическую глюкозу из крахмала.

Пектолитические ферменты используют в производстве соков и виноделии.Эти ферменты разрушают пектин, что приводит к ускорению выделения сока, увеличению его выхода, улучшению фильтрации и осветлению.

Пептидные ферменты применяют для повышения стойкости (предохранения от белкового помутнения) вина и пива. Их же используют в сыроделии вместо части сычужного фермента. Можно использовать пептидные ферменты для размягчения мяса, ускорения созревания мяса и