Отрасли экологической микробиологии

Отрасли

Основные задачи

аэромикробиология агромикробиология биогеохимия биоремедиация биотехнология качество продуктов питания синтез восстановление ресурсов качество воды

· исследование патогенов и др. микробов в аэрозолях, микробного движения в аэрозолях · биологический контроль, фиксация азота, цикл азота · углеродные и минеральные циклы, контроль потери и фиксации азота · деградация органических контаминантов, иммобилизация и удаление неорганических контаминантов почвы и воды · обнаружение патогенов и др.микробов в окружающей среде, определение микробной активности в окружающей среде, генная инженерия · обнаружение патогенов и их элиминация · синтез алкоголя, протеинов · восстановление масел, металлов, биодеградация отходов, редукция патогенов · детекция патогенов и др. видов микробов, элиминация патогенов

Экологические связи – связи, взаимоотношения между биогенными и абиогенными факторами, входящими в состав экосистемы или биосферы.

1.2. Типы межвидовых экологических связей. За основной признак Ю. Одум предложил принять изменение удельной скорости роста численности каждой из двух популяций как результат их взаимодействия. Т.о. мы рассматриваем каждую из популяций как биотический фактор внешней среды, а скорость роста популяции – как показатель её жизнедеятельности, аналогично тому, как это делают при рассмотрении влияния на организм абиотических факторов. Если две популяции сосуществуют на одном и том же местообитании, то присутствие каждой из них может, очевидно, либо способствовать ускорению роста второй, либо замедлять его, но, возможно, скорость роста одной из популяций никак не меняется при наличии второй. Обозначим ускорение роста знаком «+», замедление роста знаком «–», а отсутствие влияния – «0». Тогда получим шесть основных типов межпопуляционных взаимодействий.

Взаимодействие или Нейтрализм (00). Как говорят математики, это «вырожденный» вариант: взаимодействие, при котором каждая из популяций никак не влияет на скорость роста другой популяции.

Комменсализм (0+) Польза

В присутствии первой популяции вторая растет быстрее, но это никак не отражается на скорости первой

• Взаимодействие или аменсализм (0–)В присутствии первой популяции рост второй замедляется, но это никак не отражается на скорости роста первой

• Взаимодействие, имеющее в природе разные формы своего проявления и в зависимости от этого называемое по-разному. Если две популяции не только взаимно ускоряют рост численности друг друга,

но и вообще друг без друга существовать не могут, то такое «взаимовыгодное сотрудничество» называют мутуализмом (++).
Глубокая зависимость, невозможность раздельного существования.

Если же такое взаимодействие возникает при более или менее случайной встрече и не является остро необходимым, его называют протокооперацией.

Взаимодействие, проявляемое также в двух видах, названия которых говорят сами за себя: хищничество и паразитизм. Взаимодействие, проявляемое также в двух видах, названия которых говорят сами за себя: хищничество и паразитизм (+–).
Общее между этими двумя видами взаимодействий сводится к тому, что для одной из популяций присутствие второй несомненно «+»,

так как и для хищника, и для паразита жертва или соответственно хозяин служит пищей. Для второй популяции присутствие первой очевидный «–», так как деятельность хищника сокращает численность жертвы, а деятельность паразита, если не приводит обязательно к гибели хозяина, то может снизить его биотический потенциал в результате истощения организма.

Взаимодействие, называемое чаще всего конкуренцией (– –). Такое взаимодействие проявляется в том, что при совместном существовании скорость роста каждой из популяций оказывается меньше, чем в отсутствии конкурента. Конкуренцию можно определить как использование некоего ресурса (пищи, воды, света, пространства) каким-либо организмом, который тем самым уменьшает доступность этого ресурса для других организмов. (Р. Рифлекс «Основы общей экологии»). Симбиоз Польза. При этом плотность популяции при совместном обитании в сравнении с раздельным
обитанием:в случае симбиотических взаимоотношений одинакова.

Рассмотренные типы межпопуляционных взаимодействий не отражают всей пестроты взаимоотношений видов в реальных природных условиях, где число популяций, населяющих одно и то же местообитание, измеряется сотнями, а то и тысячам.

	1-я популяция	2-я популяция
Название	эффект	плотность популяции при совместном обитании в сравнении с раздельным обитанием	эффект	плотность популяции при совместном обитании в сравнении с раздельным обитанием
Симбиоз	польза	­ или»	польза	­ или»
Мутуализм	глубокая зависимость, невозможность раздельного существования
Антагонизм	вред	¯	вред	¯
Комменсализм	польза	­	нет эффекта	»
Нейтрализм	нет эффекта	»	нет эффекта	»

Под абиотическими компонентами следует понимать физические и химические условия экосистемы, в которой живут организмы. Размеры микробных экосистем разнообразны (пруд, озеро, корневая система дерева, ротовая полость человека, рубец жвачного животного или участок кишечника). Все жизненное пространство нашей планеты в совокупности – биосферу – можно рассматривать как гигантсткую экосистему. С той или иной экосистемой часто связывают понятие «окружающая среда». Эта среда поддерживает взаимоотношения определенного организма (популяции) с окружающими его (её) биотическими или абиотическими компонентами экосистемы.

В пределах экосистемы для каждого вида можно описать его местообитание. Это «улица» или «номер дома» данного организма; некоторые организмы могут иметь по нескольку адресов.

Например, бактерии рода Rhizobium растут как в почве, так и в растениях; определенная метанобразующая бактерия может обитать в морских отложениях, в рубце жвачных, в метантенке очистной установки.

Понятие «экологическая ниша» отражает функцию какого-то вида или популяции в сообществе организмов – это характеристика «профессии» вида. Т.е. каждый вид (или популяция) выполняет определенную функцию, которая обусловлена его потребностями в пище, подвижностью, способом размножения, биохимическими возможностями, структурными особенностями и пределами толерантности к условиям среды. Обычно границы распространения вида или популяции фактически бывают более узкими, чем возможности данного вида. Например, в рубце жвачных животных могут расти и выполнять функции расщепления целлюлозы только те целлюлозолитические бактерии, которые осуществляют это в анаэробных условиях и способны получать энергию в результате брожения. Но при этом они должны быть толерантны к температуре внутри желудка. К присутствию жирных кис лот, аммиака, газов; должно быть обеспечено непрерывное удаление определенных продуктов брожения, например, водорода. Т.е., для выполнения данной функции в определенной экосистеме вид должен обладать целым рядом специфических особенностей.

Согласно концепции, выдвинутой Виноградским в 1925 г., м/о, встречающиеся в экосистеме, можно подразделить на две категории – автохтонные и аллохтонные. Автохтонные микроорганизмы являются типичными обитателями данной экосистемы (например, почвы, кишечника) и присутствуют там всегда. Этот факт обуславливается постоянным присутствием питательных веществ, характерных для данной экосистемы (это высокоспециализированные организмы6 нитрифицирующие бактерии, обитатели горячих источников и других экстремальных систем).

Аллохтонные (зимогенные) микроорганизмы появляются в результате случайного повышения концентрации или от добавления в среду определенных питательных веществ, т.е. это временные микроорганизмы или находящиеся в состоянии покоя (вездесущие почвенные и водные бактерии).

Во многих экосистемах земной биосферы м/о занимают важное место или являются единственными формами жизни. Все экосистемы рассмотреть невозможно, мы ограничимся несколькими.

Находясь под сильным впечатлением от физиологических различий неизвестных до того бактерий, Виноградский и Бейеринк
(1900–1910) описали новые роды, такие как

Nitrozomonas, Nitrobacter, Aerobacter, Acetobacter, Photobacter, Azotobacter, Lactobacterium, Thiobacillus

Streptomyces, Actinomyces, Micrococcus, Pseudomonas, Rhizobium

Эти названия удобны и отражают экологию, физиологию и биохимию организмов

Океаны. В пищевую цепь входят: первичные продуценты –

одноклеточные водоросли – фитопланктон, бактерии, простейшие, членистоногие, рыбы. Хотя океаны поглощают и накапливают наибольшее количество солнечной энергии, они слабо участвуют в продукции пищи; лишь 5–10% производимого на Земле белка образуется в океане. Без постоянного притока питательных веществ (нитратов и фосфатов) нет хороших уловов рыбы даже в морях и не происходит загрязнения океанов и морей при поступлении в них богатых питательными веществами сточных вод.

Сульфатредуцирующие бактерии в анаэробных зонах и микро-местообитаниях превращают повсеместно присутствующие в морской воде сульфаты в сероводород, который оказывает воздействие на все остальное бактериальное сообщество. Недостаточно изучены галофильные – морские бактерии.

В озерах и пресных водоемах имеются как аэробные, так и анаэробные зоны, разделение слоев, прогреваемого солнцем поверхностного (эмпилимнион) и холодного (гиполимнион).

Слои разделены переходной зоной – термоклином (металимнионом). Последние гиполимнион и термоклин– рай для анаэробных бактерий. При наличии сероводорода и достаточной интенсивности света ниже термоклина растут зеленые и пурпурные серобактерии, образующие второй слой с высокой первичной продукцией биомассы. Первый слой биомассы образуется в эмпилимнионе с участием цианобактерий.

Водные экосистемы являются основными экосистемами процессов образования и превращения соединений серы и метана в результате деятельности сульфатредуцирующих, метан-окисляющих и редуцирующих бактерий.

Частым отображением этого единства является нормальный симбиоз человека, а также и животных с миром микробов, например с микрофлорой кишечника, дыхательных путей, кожи и др. Сущность симбионтных состояний заключается во взаимном приспособлении организма и микроорганизмов. Тем самым обеспечиваются их взаимные интересы в отношении факторов питания, размножения, иммунитета и т. д.»

Так насколько же прочные эти симбионтные отношения «человек – микрофлора»?! То, что микрофлора человека определяет микроэкологию всего организма, ученые не спорят.

Но вот механизмы этого функционирования, уровень этого участия... Здесь еще многое предстоит узнать и доказать. Известно: облюбовав человеческий организм как постоянное место жительства, мириады микробов стали вполне приличными и даже полезными жильцами.

В целом, как и любой симбиоз, это биологическое сожительство выгодно обеим сторонам. С одной стороны, заселив в свое время человека, микроорганизмы получили приличный «пансион» – оптимальную среду для выживания и размножения, да к тому же набор питательных веществ для полного цикла жизнедеятельности.

Микроорганизмы создают три дополнительных (вторичных) потока питательных веществ:

• Модифицированные биологически активные компоненты пищи

• Продукты жизнедеятельности микроорганизмов, ценные для макроорганизма

• Модифицированные балластные и токсичные продукты

Микробы, ассоциированные с нашим организмом, выполняют свыше 10 весьма полезных для здоровья человека функций – обеспечивают естественную сопротивляемость, активируют иммунную систему, синтезируют многие жизненно необходимые для нашего организма продукты (витамины, ферменты), участвуют в обезвреживании токсичных ве­ществ.

Символически биомассу бактерий человека можно представить себе в виде своеобразного органа (экстракорпорального), а еще точнее – системы. Это и есть наша микроэкология, или эндоэкология, с которой нельзя не считаться.

Теория эволюции основана на принципе естественного отбора (конкуренции), реальные факты свидетельствуют в пользу взаимовыгодного сотрудничества. В определенных условиях лучше выживают организмы, вступившие в симбиотические отношения. При этом самыми прочными и продуктивными оказываются союзы-симбиозы, где партнеры по видовой принадлежности весьма далеки друг от друга. Ботаники могут привести классический пример симбиоза – роскошные орхидеи, которые никогда не вырастишь из продезинфицированных семян (решающую роль в их прорастании играют грибки из рода ризоктония).

3. Лоренц Гильтнер (1862–1923) придавал большую значимость почвенной бактериологии и её с\х аспектам. Введенное им понятие «ризосфера» было принято во всем мире. Он работал над изучением корневых клубеньков Alnus glutinoza, паразитов злаков и т.д.

ТЕМА 10.

ОСНОВЫ ВИРУСОЛОГИИ

Для современной вирусологии характерно бурное развитие и широкое применение самых различных методик – как биологических (включая генетические), так и физико-химических. Они используются при установлении новых, до сих пор еще неизвестных вирусов, и при изучении биологических свойств и строения уже обнаруженных видов.

Каковы же те основные положения, сформулированные Робертом Кохом (1843–1910), которых должен придерживаться микробиолог при каждом обнаружении неизвестного возбудителя? Что может служить доказательством, что именно он является причиной данного инфекционного заболевания? Вот эти три критерия:

Неоднократное получение чистой культуры возбудителя, взятого из организма больного.

Возникновение точно такого же или сходного заболевания (как по характеру течения, так и по вызываемым им патологическим изменениям) при инфицировании здорового организма культурой предполагаемого возбудителя.

Появление в организме человека или животного после их заражения данным возбудителем всегда одних и тех же специфических защитных веществ. При контакте иммунной сыворотки крови с возбудителем из культуры последний должен терять свои патогенные свойства.

Фундаментальные теоретические исследования дают обычно важные сведения, которые используются в медицине, в области диагностики или при глубоком анализе процессов вирусной инфекции. Введение новых действенных методов вирусологии связано, как правило, с выдающимися открытиями.

Так например, метод выращивания вирусов в развивающемся курином эмбрионе, впервые примененный А. М. Вудрофом и Е. Дж. Гудпэсчуром в 1931 году, был с исключительным успехом использован при изучении вируса гриппа. Прогресс физико-химических методов, в частности метода центрифугирования, привел в 1935 году к возможности кристалмуации вируса табачной мозаики (ВТМ) из сока больных растений, а в последствии и к установлению входящих в его состав белков. Этим был дан первый толчок к изучению строения и биохимии вирусов.

В 1939 году А. В. Арден и Г. Руска впервые применили для изучения вирусов электронный микроскоп. Введение этого аппарата в практику означало исторический перелом в вирусологических исследованиях, поскольку появилась возможность увидеть – хотя в те годы еще и недостаточно четко – отдельные частицы вируса, вирионы.

В 1941 году Г.Херст установил, что вирус гриппа при известных условиях вызывает агглютинацию (склеивание и выпадение в осадок) красных кровяных телец (эритроцитов). Этим была положена основа для изучения взаимоотношений между поверхностными структурами вируса и эритроцитов, а также для разработки одного из наиболее эффективных методов диагностики.

Коренной перелом и вирусологических исследованиях произошел в 1949 г., когда Дж. Эндерсу, Т. Уэллеру и Ф. Роббинсу удалось размножить вирус полиомиелита в клетках кожи и мышц человеческого зародыша. Они добились разрастания кусочков ткани на искусственной питательной среде. Клеточные (тканевые) культуры были инфицированы вирусом полиомиелита, который до этого изучали исключительно на обезьянах и лишь очень редко на особом виде крыс.

Вирус в человеческих клетках, выращенных вне материнского организма, хорошо размножался и вызывал характерные патологические изменения. Метод культуры клеток (длительное сохранение и выращивание в искусственных питательных средах.

В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов в организме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы.

Серология (от лат. Serum – сыворотка, жидкая составная часть крови) – это раздел иммунологии, изучающий реакции антигена \/ специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Они связываются с определенными антигенными веществами, находящимися на поверхности вирусных частиц. В результате связывания молекул антител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса. Ее можно проводить как на животных, так и на культуре клеток.

Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить цитопатическое действие, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек.

Для обнаружения антител используется метод торможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследовательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусологический материал подготавливается для физических и химических анализов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти анализы требуют большого количества совершенно чистого вируса. Очистка вируса – процесс, при котором из суспензии с вирусом устраняются все посторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и «обломки» клеток-хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение суспензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материал для многих исследований.

Из отдельных методов очистки упомянем лишь наиболее эффективный – метод ультрацентрифугирования, который дает препараты вируса очень высокой концентрации.

Процедура получения и очистки вирусной суспензии. Процесс этот начинается с искусственного введения вируса в мозг подопытного животного. По прошествии нескольких дней вирус размножится в ткани мозга. При этом обнаружатся характерные нарушения функций нервной системы «хозяина», и у животного выявятся признаки заболевания. Когда симптомы достигнут наибольшего развития, зверька умерщвляют, а его мозг, в тканях которого содержатся большие количества вируса, извлекают в стерильных условиях из черепа животного. Затем из мозга готовится, скажем, 10 %-ная суспензия. Кроме вирионов она содержит еще и большое количество кусочков нервной ткани, остатки кровеносных сосудов, кровяные тельца и другие биологические компоненты. Кусочки ткани и другие крупные частицы устраняются первым центрифугированием со скоростью 5000-10000 оборотов в минуту. Оно продолжается около получаса. Жидкость над осадком (суперкатакт) осторожно сливают в специальные пробирки для центрифугирования, сделанные из пластмассы или нержавеющей стали, поскольку стекло не выдерживает давление, которое развивается при высокоскоростном центрифугировании. А осадок обезвреживают дезинфицирующими средствами. Слитый «супернатант» обрабатывается затем уже в ультрацентрифуге.

Для седиментации мельчайших вирусов необходимо многочасовое ультрацентрифугирование, причем полученный осадок часто бывает не больше булавочной головки. Но и после такой обработки мы имеем не совсем чистый вирусный материал, в нем еще содержатся чужеродные примеси. Для тонких

3) доказательство фильтруемости инфекционного агента (чтобы исключить патогенные агенты большего размера, например бактерии), 4) воспроизведение подобного заболевания у другого представителя данного или родственного вида и, наконец, 5) повторное выделение того же вируса.

Культивирование и идентификация вирусов - основные вирусологические методы, используемые в практической вирусологии при диагностике вирусных заболеваний. Материал, в котором подозревается наличие вируса, например лизат бактерий, кусочек ткани или биологическая жидкость, при необходимости измельчают или гомогенезируют с тем, чтобы при контролируемых условиях перевести его в суспензированное состояние.

Большие фрагменты клеток, а также возможные загрязняющие материал микроорганизмы удаляют при помощи центрифугирования и фильтрования. Такую очищенную суспензию вводят подходящему хозяину, либо добавляют к суспензии клеток, либо наносят на монослой соответствующих клеток. В результате в слое чувствительных клеток, таких, как бактерии, растущие в чашке с агаром, или клетки животных, растущие на поверхности стекла, могут появиться локальные поражения, так называемые бляшки, которые характерны для данного вируса.. Бляшки образуются в результате заражения расположенных в данной области клеток, размножения в них вируса и их полного или частичного лизиса. Если размножение вируса не ведет к образованию визуально выявляемых дискретных бляшек, вирус может быть обнаружен и охарактеризован по изменениям, вызываемым им в культуре клеток, или по повреждению слоя клеток либо при помощи других тестов. Если исследуемый материал не наносят на слой культивируемых клеток, а вводят в организм хозяина, то цель эксперимента - выявление общих реакций организма, свидетельствующих о развитии инфекции: появление симптомов заболевания, гибель животного или какие-либо иные специфические реакции, например образование антител.

Наконец, если ни заражение культуры клеток, ни введение материала в организм хозяина не ведут к появлению каких-либо симптомов вирусной инфекции, вирусологи прибегают к так называемым «слепым пассажам», т.е. к повторным переносам исследуемого материала, что часто приводит к повышению вирулентности вируса или к увеличению его титра.

Общий химический состав вирусов. Непременным компонентом вирусной частицы является какая-либо одна из двух нуклеиновых кислот, белок и зольные элементы. Эти три компонента являются общими для всех без исключения вирусов, тогда как остальные двалипоиды и углеводы - входят в состав далеко не всех вирусов.

Вирусы, состоящие только из белка нуклеиновой кислоты и зольных элементов, чаще всего принадлежат к группе простых, так называемых минимальных, вирусов, лишенных дифференциации, собственных ферментов или каких-либо специализированных структур. К такого рода вирусам принадлежат вирусы растений, некоторые вирусы животных и насекомых. В то же время практически все бактериофаги, которые по химическому составу, безусловно принадлежат к группе минимальных вирусов, на самом деле являются очень сложными и высокодифференцированными структурами. Вирусы, в состав которых наряду с белком и нуклеиновой кислотой входят также липоиды и углеводы, как правило, принадлежат к группе сложно устроенных вирусов. Большая часть вирусов этой группы паразитирует на животных.

Для изучения вирусов применяются следующие методы:

осадок надо несколько раз обработать различными реактивами и повторить ультрацентрифугирование. Только тогда можно получить концентрированную суспензию вируса высокой чистоты, которая требуется для точных и достоверных биохимических, кристаллографических анализов или для наблюдений в электронно-оптических приборах.

В распоряжении вирусологов вообще много различных технических приспособлений, как, например, центрифугирование по градиентам концентрации, когда вирионы разделяются по степеням концентрации или по форме. Другой прибор, представляющий в наше время стандартное оборудование почти каждой научно-исследовательской вирусологической лаборатории – электронный микроскоп. Это дорогостоящий, большой и сложный аппарат.

Для получения изображения вирусов существует много различных методов, и все они прошли свои этапы развития. Чтобы обнаружить вирионы в клетках, в настоящее время пользуются методом ультратонких срезов Фиксированный материал, залитый эпоксидной смолой, разрезается тончайшим стеклянным или алмазным ножом. При помощи точных ультрамикротомов одну клетку можно разрезать более чем на тысячу тонких срезов. Полученные таким образом срезы обрабатываются затем специальными химикалиями, что обеспечивает лучшую их видимость. Для наблюдения тонкого строения отдельных вирионов применяется метод негативного контрастирования (окрашивания), внедрение которого значительно повысило качественный уровень электронного микроскопирования. Вирусные частицы при этом осторожно смешиваются с раствором фосфовольфрамовой кислоты, дающей осадок, не пропускающий электронные лучи. В результате вирионы предстают в виде своих совершенно точных отпечатков, по которым можно изучать самые тонкие детали их поверхностей. При методе позитивного окрашивания (или «металлизирования» препарата) применяются такие вещества, которые способны выборочно прилипать к поверхности вирионов (например, специфические антитела, меченные ферритином, содержащим в своей молекуле железо и потому хорошо различимые в электронном микроскопе).

Общие методы изучения вирусов. О присутствии вируса в организме как при спонтанном заболевании, так и при экспериментальном заражении хозяина судят по появлению тех или иных патологических симптомов. Всякий раз, когда возникает подозрение о присутствии вируса в изучаемом объекте, приходится подбирать определенный комплекс условий – подходящий организм и соответствующий способ заражения, – при котором вирус вызывает в зараженном организме распознаваемые изменения. Так что вирусологам приходится затрачивать большие усилия на разработку методов получения экспериментальных инфекций.

Как известно, для доказательства того, что данное заболевание действительно вызывается определенным микроорганизмом, необходимо выполнить так называемые постулаты Коха: 1) показать, что данный микроорганизм регулярно обнаруживается в больном организме; 2) получить культуру этого микроорганизма на искусственной питательной среде; 3) воспроизвести данное заболевание заражением экспериментального животного выделенной культурой и, наконец; 4) повторно выделить данный микроорганизм, но теперь уже из организма искусственно зараженного хозяина. Те же постулаты mutatis mutandis справедливы и для диагностики вирусных заболеваний. В этом случае, согласно Риверсу, постулаты формируются следующим образом: 1) выделение вируса из организма больного, 2) культивирование вируса в организме или в клетках экспериментального животного.