По химической структуре лизоцим относится к полипептидам, содержащим в молекуле около 130-160 аминокислотных остатков. Он растворим в слабокислой среде, устойчив к непродолжительному кипячению, к трипсину.
Лизоцим (мурамидаза) способен расщеплять основное вещество клеточной стенки бактерии муреин путем разрушения связи между первым углеродным атомом n-ацетилмурамовой кислоты и четвертым углеродным атомом n-ацетилглюкозамина, входящего в состав клеточной стенки бактерий. В результате этого изменяется ее проницаемость.
Лизоцим является мощным защитным фактором слизистой оболочки полости рта, глаза, содержится в слезах, слюне, крови, материнском молоке, тканях различных внутренних органов. Высокая концентрация лизоцима выявляется в околоплодных оболочках и водах плода.
Основная масса лизоцима синтезируется, по-видимому, тканевыми макрофагами и нейтрофилами.
Лизоцим выполняет в организме важные биологические функции: бактерицидное действие, стимулирующее воздействие на фагоцитоз, способность нейтрализовать некоторые микробные токсины, а также противовоспалительное действие.
|
|
Наибольший литический эффект лизоцим оказывает на культуру микрококка (in vitro). Действие лизоцима можно оценить фотометрически по уменьшению оптической плотности суспензии микрококка.
Методика. Готовят исходный раствор кристаллического лизоцима 100 мг/мл, а из него 9 различных разведений.
Все разведения как лизоцима, так и бактерий, делают на 1/15 М фосфатном буфере, рН=6,2 (табл. 11).
Для приготовления взвеси бактерий смывают буферным раствором со скошенного агара суточную культуру микрококка и стандартизируют его на ФЭК-М по левому барабану до оптической плотности 0,66.
Таблица 11
Схема титрования лизоцима
| пробирки | |||||||||
1. Исследуемая сыворотка (1:10), мл | 0,02 | 0,04 | 0,06 | 0,08 | 0,10 | 0,20 | 0,30 | 0,40 | 0,50 | - |
2. Физ. раствор, мл | 0,48 | 0,46 | 0,44 | 0,42 | 0,40 | 0,30 | 0,20 | 0,10 | - | 0,5 |
В каждую пробирку с приготовленными разведениями лизоцима вносят по 2 мл взвеси микрококка и выдерживают при 37°С 30 мин в термостате. Замеряют оптическую плотность на ФЭК-М по правому барабану в кювете № 2 с зеленым светофильтром. На основе полученных данных строят калибровочную кривую.
Для определения количества лизоцима исследуемый материал в объеме 0,1 мл добавляют к 0,4 мл буфера и к полученной смеси приливают 2 мл стандартизованной смеси микрококка. Контролем является пробирка, не содержащая исследуемого материала. Инкубируют в термостате 30 минут при 37°С и на ФЭК-М определяют оптическую плотность в опытной и контрольной пробирках. По калибровочной кривой устанавливают концентрацию лизоцима в исследуемом материале.