Самостоятельная работа студентов. 1. Иммуноферментный анализ (ИФА - демонстрация). Антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) адсорбированы на дне лунок по­листироловой пластины

1. Иммуноферментный анализ (ИФА - демонстрация). Антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) адсорбированы на дне лунок по­листироловой пластины. В лунки внесены исследуемые образцы сывороток крови. Контроли: 1 - эталонная сыворотка с антителами против ВИЧ (положительный контроль), 2 - сыворотка, не содержащая антител ВИЧ (отрицательный контроль). Реакция проходит при 37⁰ С в течение I часа. После отмывки во все лун­ки вносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченую ферментом (пероксидаза хрена), выдерживают 1 час при 37⁰, после чего вновь отмывают. Во все лунки вносят перекись водорода, которая расщепляется пероксидазой и индикатор (ортофенилендиамин), изменяющий свой цвет в результате химической реакции. Учет ре­акции производят на специальном (вертикальном) спектрофотометре. Положительный контроль характеризуется окра­шиванием среды в лунке в красно-коричневый цвет, так как в эталонной сыворотке содержались антитела к ВИЧ, вступившие в реакцию с антигенами, адсорбированными на дне лунки пластины. При добавлении меченой пероксидазой сыворотки против иммуногло­булинов человека антитела меченой сыворотки соединяются с антителами эталонной сыворотки и после второй отмывки также остаются в лунке. Поэтому в лунке контроля 1 произошла выраженная химическая реакция. Контроль 2 - бес­цветный, так как в сыворотке, внесенной в эту лунку, не со­держались антитела к ВИЧ- вирусу, поэтому в этой лунке не произошло цветной реакции с сывороткой против иммуноглобулинов человека, меченой пероксидазой. Интенсивность окраски в опытной лунке зависит от уровня антител к ВИЧ в исследуемой сыворотке,

2. Радиоиммунный анализ (РИА - демонстрация). Сущность РИА сходна с ИФА, однако сыворотку про­тив иммуноглобулинов человека метят не ферментом, а радиоактивным изотопом (Н³- тритием, С¹⁴, I¹²⁵, и т.д.).Результаты реакции учитывают с помощью д. и д. анализаторов. Студенты знакомятся с оборудованием для РИА.

3. Иммунофлюоресцентный метод (ИФМ - демонстрация). Антитела против антигенов вирусов и бактерий за счет ковалентных связей метят флюоресцирующим веществом (чаще всего изотиоцианатом флюоресцеина). Готовят микропрепараты на предметных стеклах из материала от больного (смыв из носоглотки, отделяемое бубона, мазки-отпечатки из трупного материала и т.д.) и обрабатывают их флюоресцирующей сывороткой. Если в микропрепаратах имеются антигены соответствующие антителам флюоресцирующей сыворотки, то антитела соединяются с ними и при люми­несцентной микроскопии образовавшиеся комплексы будут светиться. Эта модификация ИФМ называется прямой. При непря­мом ИФМ микропрепарат обрабатывают сначала обычной сывороткой против определенного антигена, а затем - антиглобулиновой флюоресцирующей сывороткой. Метод иммунофлюоресценции широко применяется для диагностики различных инфекций, в частности, гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний. Студенты микроскопируют и зарисовывают клетки цилиндрического эпи­телия носоглотки человека, пораженные вирусом гриппа (прямой метод иммунофлюоресценции).

Студенты знакомятся с основными методами оценки иммунного статуса организма человека в демонстрации.

1. Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов с помощью иммунофлюоресцентного метода (демонстрация). Лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови центрифугированием на градиенте фиколл-верографина (плотность 1,077 г/мл). 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в центрифужные пробирки или лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD-3 – Т-лимфоциты, CD-4 – Т-хелперы, CD-8 – цитотоксические Т-киллеры/супрессоры, CD-19 – В-клетки) и инкубируют 30-45 мин при +4⁰ С. Затем клетки дважды отмывают на центрифуге при 1200 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляют. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab')2 -фрагментов овечьих антител к Ig мыши в разведении 1:100, меченых флюоресцеином. Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4⁰ С. После этого клетки 2 раза отмывают на центрифуге, добавляют 50 мкл 1% параформальдегида (или формалина в разведении 1:40), суспендируют и анализируют на проточном цитофлюориметре или просматривают с помощью флуоресцентного микроскопа, определяя процент флуоресцирующих клеток. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, однако вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса или нормальным Ig мыши.

2. Методы оценки функций лимфоцитов (демонстрация). Функциональную полноценность Т-лимфоцитов косвенно оценивают с помо­щью кожных проб, отражающих интенсивность реакций ГЗТ в отношении распространенных микробных аллергенов (кандидозного, стрептококковых, туберкулина и т.д.). Аллерген вводят внутрикожно и через 48 ч измеряют диаметр инфильт­рата — уплотнения, отражающего интенсивность реакции ГЗТ.

Одной из функций лимфоцитов является их пролиферация в ответ на действие антигенов – индукторов пролиферации - так называемых неспецифических поликлональных митогенов. Для Т-лимфоцитов распространенным поликлональными митогенами является фитогемагглютинин, полученный из бобов расте­ний), для В-лимфоцитов — компоненты бактерий (липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий, А-протеин стафилококка и т.д.). Для количественной оценки пролиферации клеток обычно исследуют включение радиоактивной метки (Н3-тимидина) в ДНК клеток как показатель их пролиферации. Этот тест пролиферативной активности лимфоцитов называется реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Другой подход к оценке функций Т-лимфоцитов заключа­ется в измерении их способности продуцировать цитокины, появляющиеся при активации Т-лимфоцитов антигенами (митогенами). Определение ти­пов цитокинов и их количества в культуральной среде Т-лим­фоцитов позволяет оценить функциональную активность кле­ток. Количество цитокинов определяют по их биологической активности или с помощью ИФА.

Функции В-лимфоцитов косвенно оценивают по уровням иммуноглобулинов, изогемагглютининов и нормальных антибактериальных антител в сыворотке крови.

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ – демонстрация). Реакция основана на способности лимфоцитов после повтор­ного контакта с антигеном, к которому они были ранее сенсибилизированы, продуцировать лимфокины, влияющих на миграцию гранулоцитов, моноцитов, макрофагов. РТМЛ периферической крови в присутствии причинного антигена позволяет выявить специ­фическую сенсибилизацию Т-лимфоцитов. РТМЛ ставят в ка­пиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейко­цитов крови в присутствии и в отсутствие причинного мик­робного антигена, после чего измеряют зоны миграции (в про­центах) в присутствии антигена по сравнению с контролем, принятым за 100 %. В случае выявления сенсибилизации к антигену на­блюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже 100 %).

2. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови человека методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (демонстрация). В 3 пробирки с расплавленным и остуженным до 50⁰ С агаром вносят соответственно сыворотки против иммуноглобулинов человека классов М, А, G. Содержимое пробирок разливают на 3 стек­лянных или пластиковых пластины. После застывания агара в нем на расстоянии 1 см друг от друга вырезают лунки. В лунки вно­сятся исследуемые и эталонные сыворотки с известным содержанием иммуноглобулинов. Иммуноглобулины исследуемых сы­вороток диффундируют в агар и образуют зону преципитации вокруг лунки, взаимодействуя с антителами, находящимися в агаре. Измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки и сравнивают с диаметром кольца преципитации эталонной сыворот­ки. Используя калибровочную кривую или специальную компьютерную программу, определяют уровень иммуноглобулинов в сыворотке в г/л.

3. Оценка фагоцитарного звена иммунитета (демонстрация). Цитратную кровь или лейкоцитарную взвесь инкубируют с бактериями или другими объектами (частицы латекса, дрожжи и т.д.) в течение 30 минут, после чего готовят мазок, окрашивают по методу Романовского-Гимза и микроскопируют. Подсчитывают 100 клеток для определения процента фагоцитирующих клеток (в норме 40-80%) и количества бактерий захваченных 1 фагоцитирующей клеткой (в норме – 1-5).

Кроме того оценивают интенсивность окислительного взрыва в фагоцитах (косвенный показатель бактерицидности) по способности восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме фагоцитов глыбок темно-синего формазана. Чем ак­тивнее окислительный взрыв в фагоцитах, тем большая доля клеток содержит осадок формазана. После подсчета клеток доля формазан-положительных выражается в процентах. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц только с красителем без индуктора окислительного взрыва доля формазан-положительных клеток не превышает 1—2 %. Инкубация лейкоцитов здоровых лиц с индуктором окислительного взрыва (объекты фагоцитоза, бактериальные полисахариды) приводит к окислительному взрыву всех 100 % фагоцитов и накоплением осадка формазана. Снижение доли формазан-положительных клеток свидетельствует о де­фектности кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов.

2. Титрование комплемента сыворотки крови (демонстрация). Метод основан на феномене комплементзависимого лизиса нагружен­ных антителами эритроцитов барана. За единицу активности комплемента принимается такое его количество, которое вызывает гемолиз 50 % сенсибилизированных эритроцитов (СН50).

В пробирку с сывороткой крови в разведении 1:10 добавля­ют гемолитическую систему (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой кролика), ин­кубируют 45 минут при 37⁰ С, сохранившиеся эритроциты осаждают цент­рифугированием. Интенсивность гемолиза регистрируют с помощью спектрофо­тометра или фотоэлектроколориметра. У здоровых людей титр комплемента составляет 40—80 СН50 на 1 мл.

Титрование комплемента по 50 % гемолизу не позволяет судить о состоянии отдельных компонентов системы компле­мента. В настоящее время выпускаются иммуноферментные тест-системы для определения отдельных компонентов системы комплемента.

В последние годы налажен выпуск иммуноферментных систем для определения различных цитокинов. Исследование уровня цитокинов при различных патологических состояниях дает ценную информацию для диагностики ряда болезней и назначения обоснованного лечения.