Вопрос 6Биотехн

Последние достижения в области геномики и протеомики позволяют решать проблемы поиска безопасным и эффективных ЛС.

Какое значение имеют гены вирулентности и в чем суть метода IVET?

Гены патогенна можно разделить на две группы. Первая объединяется под названием «house keeping genes» (гены, на которых держится «дом», т.е. клетка; они всегда необходимы для ее существования). Вторая, менее изученная группа, получившая условное название «гены вирулентности», существенна для сохранения жизнеспособности патогена только в условиях инфицированного организма. Кроме генов, непосредственно обусловливающих образование адгезинов и инвазинов, что способствует колонизации бактериальным патогеном животных тканей, в эту группу входят и гены, обязательные для выжимания патогена в условиях воздействия на него факторов иммунитета, гены, позволяющие микроорганизму преодолевать дефицит некоторых метаболитов и неорганических ионов (например, пуринов и железа), что специфично для животных тканей, а также гены, кодирующие некоторые регуляторные системы.

Подавление генов вирулентности не вызывает прекращения роста патогена in vitro, поскольку в этом случае гены вирулентности патогену не нужны.

Однако в условиях in vivo значение генов вирулентности для патогена сравнивается со значением «house keeping genes», и их подавление будет приводить к антимикробному эффекту.

Инигибиторы генов вирулентности оказываются особенно ценными лекарственными веществами. Во-первых, к ним гораздо медленнее, чем к ингибиторам образования, например, клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины) или белка (стрептомицин, тет-рациклины, эритромицин и др.), должна развиваться резистентность. Они не будут факторами селекции и распространения резистентных форм бактерий. Во-вторых, гены вирулентности высоко специфичны для патогена: близких к ним генов в клетках организма человека нет. Это значит, что ингибиторы, отобранные по действию на гены вирулентности, более безопасны для человека, чем отобранные по другим тестам.

Для того чтобы использовать гены вирулентности (их продукты) в системе отбора ингибиторов, надо предварительно идентифицировать, а затем клонировать каждый такой ген. Это не просто, так как гены вирулентности экспрессируются только in vivo, т.е. в инфицированном животном организме. Тем не менее недавно удалось преодолеть эту преграду. Был разработан..1методЬ получивший название «in vivo expression technology» (<IVET^). Он основан «на захвате промотора» и использовании целостного животного организма как селективной среды, выявляющей экспрессию генов вирулентности. Геном изучаемого патогена пре-вращается с помощью рестриктаз (ферментов, разрезающих ДНК) в набор рестриктов -фрагментов ДНК, в которых оказываются отдельные гены, в том числе и гены вирулентно-сти со своими промоторами. Отдельные рестрикты включаются в построенные на основе плазмид векторы, содержащие ген, позволяющий несущей плазмиду клетке выживать и размножаться в условиях животного организма (например, ген purA, позволяющий обеспечить клетку пуринами). Вектор вводят в «модельный» организм, например E.coli. Однако в сконструированном векторе ген purA специально лишают промотора (участка, с которого начинает «считываться» ген), и он может экспрессироваться только за счет промотора чужого гена, который встраивается в вектор перед геном purA. Если промотор чужого гена (в рестрик-те) будет работать in vivo, в организме животного будут находиться микробные клетки (E.coli) с вектором, обеспечившим эти клетки пуринами.

Естественно, встает вопрос, работает ли в этом случае промотор гена вирулентности или промотор одного из «house keeping genes». Последние в данном случае интереса не представляют. Для того чтобы решить эту задачу, конструкцию вектора усложняют. После гена purA в него включают также лишенный промотора ген lacY. Прошедшие селекцию в животном организме микробные клетки высевают на твердую индикаторную среду с лактозой. В слу-1 чае действия промотора одного из «house keeping» генов экспрессия системы рестрикт purA -lacY будет происходить не только in vivo, но и in vitro (колонии будут окрашены). Если же система экспрессировалась только in vivo, a in vitro не экспрессируется - колония не будет окрашена. Отбираются именно такие колонии, а рестрикт, включенный в вектор и содержащий ген вирулентности, подвергается дальнейшему изучению.

Об объеме экспериментов, проводимых с использованием IVET, можно судить, например, по исследованию, в котором проводилась индентификация генов вирулентности Salmonella typhimurium: из 212 ООО колоний (на индикаторной среде) было отобрано 2647 неокрашенных. При анализе клонированных в векторах рестриктов было идентифицировано более 100 генов (относящихся к генам вирулентности), из них более 50 оказались ранее не описанными, т.е. не имели гомологии с генами, представленными в базах данных, и функции их продуктов были неизвестны.

Независимо от наличия сведений о биохимической функции существенного гена его последовательность амплифицируется с помощью недавно разработанного, но уже широ ко внедренного в практику метода ПЦР (полимеразной цепной реакции), затем нарабаты вается продукт экспрессии гена. Этот белок становится основой биохимической системы скрининга ингибиторов его активности - потенциальных антимикробных веществ.

В целом можно сказать, что секвенирование генома позволяет в конечном счете выявит!, абсолютно все уязвимые места клетки патогена как при росте in vitro и in vivo, так и только in vivo, что для клинической практики не менее, а может быть даже и более, важно.