Задания к лабораторному занятию. 1. Изучите выросшую культуру на скошенном агаре, приготовьте мазок, окрасьте по Граму

1. Изучите выросшую культуру на скошенном агаре, приготовьте мазок, окрасьте по Граму.

Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. В случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.

2. Посейте чистую культуру микроорганизмов на среды Гисса.

Пробирки с набором сред Гисса поставьте в штатив в один ряд. На каждой пробирке подпишите название сахара, содержащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда кроме названия сахара укажите исследуемую культуру. Произведите посев.

3. Определите наличие протеолитической активности микробов на мясо-пептонном желатине.

Посев произведите уколом, погружая петлю с исследуемой культурой вглубь питательной среды до дна пробирки.

Там, где под действием протеолитических ферментов микробов произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды.

4. Определите индолообразование выделенной культуры микроорганизмов.

Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засейте в пробирку с мясо-пептонным бульоном. После посева в пробирку внесите полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Посевы инкубируют в термостате 24-48 ч. при температуре 37ºС. Образование индола определяют по окрашиванию бумаги в бледно-розовый цвет.

5. Определите способность изучаемой культуры микроорганизмов выделять сероводород.

Петлю исследуемой культуры засейте в пробирку с мясо-пептонным бульоном. Затем в пробирку внесите пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

Тема: Дыхание бактерий. Брожение. Методы выделения чистых культур анаэробов.

Цель: Освоить методы выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов.

Вопросы для самоподготовки

1. Типы дыхания микроорганизмов.

2. Сущность процесса дыхания микробов.

3. Особенность процесса брожения.

4. Принципиальное различие дыхания и брожения, как энергетических процессов бактериальной клетки.

5. Питательные среды для культивирования анаэробов.

6. Методы культивирования анаэробов:

а) физический;

б) химический;

в) биологический.

Литература

1. Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробио­ло­гия. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 57-58.

2. Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руково­дство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 36-42.

Как отмечалось в разделе о питании бактерий, поступающие в микробную клетку питательные вещества трансформируются в составные части цитоплазмы, ядрные субстанции, оболочки клетки и т. д. Для этих сложных синтетических процессов необходима затрата определённого количества энергии, которую микробная клетка должна получать для поддержания своей жизнедеятельности также непрерывно, как и пита­тельные вещества.

Затрата энергии необходима не только для синтетических процессов, но и для всех других многочисленных проявлений жизнедеятельности бактерий. Сюда отно­сятся рост и размножение микробов, их движение, образование спор и капсул, вы­работка токсинов.

Микробные клетки всю необходимую энергию получают за счет экзотермиче­ских химических реакций, осуществляемых путём окисления различных химиче­ских соединений, обладающих большими запасами потенциальной энергии.

Совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности клеток, называется дыханием или биологическим окислением. Бактериальные клетки, имея относительно простую структуру и чрезвычайно малые размеры, отличаются большим разнообразием ти­пов дыхания.

В дыхании микроорганизмов определяющую роль играют окислительные фермен­ты, причем различные типы дыхания микробов связаны с определённым на­бором их ферментов.

В химизме дыхательных процессов всех типов дыхания микроорганизмов имеется много общего, однако, по специфичности определенных стадий реакции выде­ляет aэрoбный, анаэробный и смешанный тип дыхания.

Во всех случаях первым этапом дыхания является отнятие водорода от суб­страта с помощью специфических ферментов - дегидрогеназ. А так как в структуре атома водорода на орбите имеется один электрон, то процесс отнятия электрона водорода от субстрата расценивается как окислительный субстрат – H₂ + дeгидpoгинaзa ® oкиcленый субстрат +дегидрогеназа – Н_2.

Эта реакция является примером реакции окисления - восстановления. Сущность окисления состоит в потере электронов окисляющимся веществом, тогда как сущность восстановления состоит в присоединении электронов восстанавли­вающимся веществом.

В приведенной выше реакции фермент дегидрогеназа восстанавливается вследствие присоединения электронов водорода субстрата.

Последовательность биохимических реакций в протекании обменных процессов в бактериальной клетке возможна благодаря изменениям окислительно-восстановительного потенциала (гН₂), под которым понимают способность вещества отдавать или получать электроны.

Окислительно-восстановительный потенциал зависит от температуры, pH сре­ды и других причин. Он может изменяться в зависимости от аэробиоза или анаэро­биоза. Строгие анаэробы растут при гН₂ - 0-12, факультативные анаэробы при 0-20, аэробы при гН₂ - 14-20.

Бактерии в большинстве случаев получают необходимую энергию для своей жизнедеятельности путём окисления углеводов и некоторых органических кислот.

У аэробов процесс расщепления углеводов происходит путём окислительных реакций. При этом вещество разлагается до самых простых соединений – Н₂О, CO₂ и др. с выделением большого количества тепловой энергии.

Процесс аэробного расщепления одной грамм-молекулы глюкозы можно представить следующим образом:

С₆H₁₂О₆ + 6O₂ = 6CO₂ + 6Н₂О + 674 калории.

В анаэробных условиях расщепление вещества происходит за счёт сложных внутримолекулярных химических превращений в бактериальной клетке, которое обеспечивается особой системой ферментов. Расщепление углеводов в анаэробных условиях называется процессом брожения. Пастер показал, что брожение, в зависимости от видов микробов, которые его обусловливают, может быть спиртовым, маслянокислым, уксуснокислым. Это значит, что в процессе брожения образуется не только углекислый газ и вода, но и ряд более сложных продук­тов: винный спирт, масляная или уксусная кислоты. Количество освобождающейся энергии в процессе брожения намного меньше, чем приаэробном дыхании.

Та же грамм-молекула глюкозы под действием дрожжевых клеток в анаэробных условиях расщепляется с освобождением всего лишь 27 калорий

С₆Н₁₂О₆ ® 2С₂Н₅ОН + 2СО₂ + 27 калорий.

Маслянокислые бактерии расщепляют грамм-молекулу глюкозы с образованием 15 калорий.

С₆Н₁₂О₆ ® CH₃CH₂CH₂COOH + 2CO₂ + 2H₂ + 15 калорий.

Общность процессов аэробного дыхания и брожения выражается в том, что в обоих случаях расщепление углеводов до определённого момента идет по одному пути и сопровождается появлением одних и тех же промежуточных продуктов и лишь на конечных этапах в случаях анаэробных процессов распад углевода идёт до спирта, молочной кислоты или других продуктов неполного окисления, а при аэробном - до полного окисления т. е. до углекислоты и воды.

В энергетическом отношении аэробное дыхание целесообразнее анаэробного. Так, если при аэробном процессе окисление глюкозы до С0₂ и Н₂О освобождается 674 калорий, то при спиртовом брожении - 27 калорий, а при маслянокислом всего лишь 15 калорий. Это объясняется тем, что конечные продукты, получаемые в результате анаэробного окисления, представ­ляют собой сложные органические соединения, имеющие большой запас энергии. Это приводит к тому, что значительная часть освобождающейся при анаэробном дыхании улетучивается в виде тепла и только 30 % выделившейся энергии используется в процессах жизнедеятельности бактерий.