Простая радиальная диффузия

Принцип метода. Этот метод отличается более высокой чувствительностью, чем предыдущий, так как антисыворотка входит в состав агара, в который из лунки диффундирует антиген. По мере удаления от лунки концентрация антигена постепенно падает, пока не становится эквивалентной концентрации антител в агаре. Этот метод впервые описал Манчини в 1963 г.

Методика. Растворяют 1,5 г агара в 100 мл буфера (0,15М NaCl) на водяной бане, охлаждают до 48^оС и смешивают с АС, желательно подогретой до той же температуры, в небольшой пропорции. Наносят пипеткой 2 мл смеси на предметное стекло, установленное строго горизонтально на подставке, нагретой до 35-40^оС. Золь агара, содержащий антитело, распределяется по поверхности предметного стекла и застывает слоем, толщиной 1 мм. На предметном стекле в слое геля вырезают по 8 лунок при помощи стеклянной трубки, соединенной с водоструйным насосом (таким образом создают пониженное давление). В каждую из лунок вносят по 2 мкл раствора антигена. Реакцию простой радиальной иммунодиффузии проводят во влажной камере. Если линии преципитации достаточно выражены, оценку результатов можно проводить прямо на влажной пластинке. В других случаях, пластинки с гелем отмывают 2-3 раза в 0,15 М NaCl; каждая отмывка длится 12 часов. Этим достигается удаление непреципитированных белков. После отмывки препараты высушивают и окрашивают, например, амидо черным 10В. При этом образуется хорошо различимое кольцо преципитации. Чем выше концентрация внесенного антигена, тем больше диаметр кольца. Если в реакции используется несколько стандартов с известной концентрацией антигена, то путем сравнения или постройки колибровочной кривой можно проводить количественное определение антигена в образцах.

Для определения титра антител смешивают гель в установочной пропорции с антигеном, антитела диффундируют в гель (обратная радиальная иммунодиффузия). Радиус колец преципитации пропорционален титру.