2015-02-27
1216
Это обмен генетического материала мужду бактериями путем встраивания фрагмента хромосомы бактерии донора в хромосому бактерии рецепиента в процессе трансформации, трансдукции или коньюгации. Образующиеся рекомбинанты несут хромосому рецепиента, в которую включаются только отдельные фрагменты хромосомы донора (в этом существенное отличие от полового процесса эукариотов, потомство которых получает полный хромосомный набор обоих родителей).
I. Конъюгация – передача генетического материала от бактерий доноров к реципиентам путем их непосредственного контакта.
Поставить опыт коньюгации по передаче маркеров pro, thr-leu в скрещивании типа Hfr × F у кишечной палочки, для этого в опыт берут:
1) E.coli с Hfr – донор с генотипом pro+, thr+, leu+, str чувствительный;
2) культуру-рецепиент с генотипом pro-, thr-, leu-, str thr-leu.
Получение бактериальных культур. Суточные культуры пересевают на бульон и выращивают при хорошей аэрации в течение 3 часов.
Опыт коньюгации проводят в чашках с селективной средой – минимальным агаром с добавлением глюкозы и стрептомицина.
Постановка опыта коньюгации:
1. В опытную пробирку в отношении 1:10 вносят культуру донора (0,1 мл) и реципиента (0,9 мл). Скрещиваемую смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Этого времени достаточно для вхождения проксимальных маркеров pro, thr, leu. При необходимости передачи всех хромосом смесь выдерживают 2 ч.
2. Ставят два контроля: донора и рецепиента. Обе культуры разводят в 100 раз (0,1 мл культуры + 9,9 л физиологического раствора) и высевают по 0,1 мл на чашки с селективной средой, на которой они расти не могут, так как культура-донор чувствительна к стрептомицину, а рецепиент является ауксотрофом.
3. После инкубации скрещиваемую смесь разводят на 100 раз физиологическим раствором и засевают в обьеме 0,1 мл на селективную среду, на которой будут расти только прототрофные рекомбинанты. Опыт коньюгации учитывают через 24–48 ч. На контрольных чашках роста быть не должно, на опытной чашке вырастут рекомбинанты, число которых подсчитывают.
II. Трансдукция – перенос генетического материала от бактерий-доноров к реципиентам с помощью трансдуцирующего фага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию и специфическую. При неспецифической фаг (Р1, Р22) может включать различные фрагменты бактериальной хромосомы и передавать их клеткам-реципиентам. При специфической трансдукции возможен перенос только строго определенных генов. Специфически трансдуцирующим фагом является фаг «лямбда», который способен переносить гены gal и bio.
Опыт по передаче gal маркера кишечной палочке. Берут:
1) трансдуцирующий фаг «лямбда», выделенный из лизогенной культуры донора E.coli gal+ путем индукции УФ-светом;
2) культуру E.coli gal- реципиент.
Опыт проводят на чашках с селективной средой, содержащей галактозу (среда ЭМС с индикатором эозин + метиленовый синий).
Постановка опыта трансдукции:
1. В опытную пробирку вносят 0,9 мл 3-часовой бульонной культуры-реципиента и 0,1 мл фаголизата трансдуцирующего фага «лямбда» в концентрации 10 частиц/мл (множественность инфекции 1,0). Смесь выдерживают при 37 °С в течение 30 мин.
2. Ставят 2 контроля: фаголизата на стерильность и культуры-реципиента, высевая их по 1,0 мл на чашки с селективной ЭМС-средой.
3. После инкубации делают высев 0,1 из опытной пробирки с трансдуцирующей смесью на чашку с селективной ЭМС-средой. Опыт учитывают через 48 ч. В контроле фаголизата рост должен отсутствовать. В контроле культуры-реципиента, не расщепляющей галактозу, микробы должны расти в виде бесцветных колоний. На опытной чашке вырастают окрашенные колонии трансдуктантов на фоне прозрачных, бесцветных колоний культуры-реципиента.
III. Трансформация – изменение свойств бактерий-реципиен-тов под влиянием ДНК, выделенной из бактерий доноров, т.е. непо-средственная передача фрагмента ДНК донора клетке-реципиенту.
Учесть опыт передачи устойчивости к стрептомицину у Bacillus subtilis.
В опыт были взяты:
1) ДНК, полученная из стрептомициноустойчивой культуры-донора;
2) стрептомициночувствительная культура-реципиент (в компетентном состоянии).
Опыт поставлен на чашках с МПА, в который добавлен стрептомицин в количестве 100 ед/мл.
Постановка опыта трансформации:
Культуру компетентных клеток соединяют в равных объемах с ДНК (например, по 0,5 мл). Выдерживают смесь в термостате 30 мин для контакта, после чего проводят высев на чашки с МПА и стрептомицином – по 0,2 мл смеси. Ставят 2 контроля: 1) высев на чашку ДНК; 2) высев стрептомициночувствительной культуры-реципиента.
Опыт учитывают через 24–48 ч. В обоих контролях рост должен отсутствовать, на опытных чашках вырастают колонии трансформантов, которые приобрели признак стрептомициночувствительности.
IV. Плазмиды – внехромосомные генетические структуры бактерий, представляющие собой циркулярные молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Плазмиды располагаются в цитоплазме бактериальной клетки, некоторые могут включаться (интегрировать) в хромосому.
