Молекулярная абсорбционная спектроскопия

Молекулярной абсорбционной спектроскопией в УФ- и видимой областях электромагнитного спектра называют спектрофотометрией или фотометрией. Молекулярные абсорбционные спектры в УФ- и видимой областях спектра состоят уже не из отдельных чётко определённых линий, как это имело место в случае атомно-абсорбционной спектроскопии, а из широких полос. Это вызвано следующими основными причинами. Как и атомы молекулы могут поглощать только такое электромагнитное излучение, энергия которого точно равна разности между энергиями основного и возбуждённого состояний. Однако полная энергия молекулы является суммой энергии электронного состояния , энергии колебания атомов, входящих в её состав и энергии вращательного движения данной молекулы , причём:

Каждому электронному состоянию молекулы соответствует целая группа колебательных, а каждому колебательному, в свою очередь, большое число вращательных состояний. Энергия электромагнитного излучения УФ- и видимого диапазона соответствует энергии возбуждения валентных электронов. Для того чтобы произошёл переход молекулы из одного колебательного состояния в другое без изменения её электронного состояния, достаточно энергии ИК-излучения, а между двумя вращательными энергетическими уровнями в пределах одного и того же колебательного - энергии излучения микроволнового диапазона.

Рис. 20. Электронные переходы в гипотетической молекуле.

При поглощении электромагнитного излучения УФ- или видимого диапазона, молекула переходит из некоторого колебательного и вращательного состояния электронного уровня в некоторое колебательное и вращательное состояние следующего электронного уровня. Каждый образец вещества содержит огромное число молекул. Даже если все они находятся в основном электронном состоянии, то при этом они могут находиться в разных колебательном и вращательном состояниях. Поэтому вещество будет поглощать не только электромагнитное излучение, соответствующее переходу между самыми низкими колебательными и вращательными состояниями основного и возбуждённого электронного уровней, но и излучение с близкими длинами волн. Кроме того, в многоатомных молекулах возможно множество электронных переходов и они могут быть достаточно близки между собой по энергии, поэтому в спектре поглощения отдельные полосы поглощения могут сливаться друг с другом.

Рис. 21. Спектр поглощения алкалоида берберина бисульфата (водный раствор).

Основными характеристиками полосы поглощения являются её положение и интенсивность. Положение максимума полосы поглощения соответствует длине волны такого электромагнитного излучения, энергия которого равна энергии необходимой для электронного перехода. Для характеристики ширины полосы поглощения пользуются величиной полуширины полосы поглощения. Интенсивность поглощения, которую можно охарактеризовать с помощью молярного коэффициента поглощения, зависит от вероятности данного электронного перехода. Так, поглощение считается интенсивным (максимально возможное значение составляет примерно ) если значение превышает величину и малоинтенсивным, если величина меньше , что является малоинтересным для аналитической практики. Объектами исследования в спектрофотометрии чаще всего являются органические вещества. При этом в органических соединениях могут происходить четыре типа электронных переходов: , , и . Энергия первых двух типов электронных переходов соответствует энергии УФ-излучения вакуумного диапазона (например, в молекуле этана - 135 нм, в молекуле метанола - 183 нм). Энергия переходов изолированных связей -типа соответствует электромагнитному излучению с длиной волны меньше 200 нм, например в молекуле этилена - 165 нм. В случае сопряжённых систем линейного и ароматического типов, в которых имеет место сопряжения нескольких -связей, полосы поглощения смещаются в более длинноволновую область электромагнитного спектра.

Рис.22. Основные характеристики полосы поглощения.

Группы, обуславливающие появление полос поглощения в молекулярных спектрах, называются хромофорами. Атомы или группы атомов, которые сами по себе не влияют на появление полос поглощения, но влияют на характер поглощения хромофоров, называются ауксохромами. Ауксохромы имеют неподелённые электронные пары, находящиеся в сопряжении с -электронной системой хромофора, и могут сдвигать полосу поглощения хромофора в более длинноволновую область электромагнитного спектра (батохромный сдвиг) или в более коротковолновую область спектра (гипсохромный сдвиг), увеличивать её интенсивность (гиперхромный эффект) или наоборот уменьшать её (гипохромный эффект). Объектами исследования в фотометрии обычно являются растворы. Принцип измерения аналитического сигнала в молекулярной абсорбционной спектроскопии заключается в сравнении исследователем интенсивности двух световых потоков, один из которых проходит через раствор, а второй - через раствор сравнения. В зависимости от устройства и функциональных возможностей, все приборы, используемые в молекулярном абсорбционном анализе классифицируют по разным признакам. Так, в зависимости от количества используемых световых потоков, различают однолучевые и двухлучевые приборы. В зависимости от способа регистрации аналитического сигнала все приборы делят на регистрирующие и нерегистрирующие. В зависимости от того, каким образом происходит выделение из непрерывного спектра испускания источника нужного спектрального интервала, способа и степени монохроматизации излучения, все абсорбционные спектрометры можно разделить на фотоэлектроколориметры и спектрофотометры. Несмотря на такое деление и классификацию, принцип действия, лежащий в основе устройства каждого из таких приборов один и тот же: источник излучения, устройство для выделения спектрального интервала, кюветное отделение, детектор и регистрирующее устройство для вывода аналитического сигнала, что может быть отражено в приведенной ниже схеме однолучевого прибора для измерения светопоглощения в УФ- и видимой областях электромагнитного спектра.

Рис. 23. Принципиальная схема однолучевого прибора для измерения светопоглощения в видимой и УФ-областях.

Для получения видимого и длинноволнового УФ-излучения используют часто используют дейтериевую лампу, а также лампу накаливания. Неплохо зарекомендовали себя также галогеновые лампы. Источники излучения, используемые в фотометрии, дают непрерывные спектры. В фотоэлектрокаллориметрах для выделения нужного интервала длин волн применяют набор светофильтров. Величина полуширины пропускания используемых светофильтров составляет в среднем 25-45 нм. Нижняя граница рабочих длин волн составляет для большинства моделей фотоэлектрокаллориметров примерно 315 нм. Фотоэлектрокаллориметры используют обычно для проведения серийных измерений концентрации веществ, поглощающих в видимой или длинноволновой УФ-области электромагнитного спектра. В спектрофотометрах для выделения из спектра испускания источника излучения с нужной длиной волны применяют монохроматоры: дифракционные решётки и призмы. Монохроматор позволяет получить электромагнитное излучение с гораздо более высокой степенью монохроматичности, чем светофильтр. Спектрофотометры имеют более сложное устройство, чем фотоэлектроколориметры и используются для получения спектров поглощения веществ, а также определения концентрации веществ при длинах волн менее 300 нм, имеющих узкие полосы поглощения и т.д. Растворы веществ, поглощение которых измеряется, помещают в специальные сосуды прямоугольной или, реже, цилиндрической формы, называемые кюветами. Кювета, содержащая раствор исследуемого вещества, называется рабочей, а кювета, содержащая раствор сравнения - кюветой сравнения. Кюветы, применяемые для работы в видимой области спектра, могут быть сделаны из стекла. Для работы в области длин волн меньше 325 нм необходимы кварцевые кюветы. В качестве материала для изготовления кювет используются также органические полимеры. Как правило, каждый прибор для фотометрических измерений снабжён набором кювет (толщиной от 0,1-5 см). Чаще всего в работе, особенно для спектрофотометров, используются кюветы с толщиной 1 см. Кроме обычных кювет существуют кюветы специальной конструкции, например, термостатированные, проточные. В однолучевых приборах в поток излучения вначале помещают кювету сравнения и настраивают по ней прибор на ноль оптической плотности. Затем в поток помещают рабочую кювету. При изменении настройку прибора следует повторить. В двухлучевых спектрометрах поток, выходящий из монохроматора, с помощью зеркала специальной конструкции расщепляется на два одинаковых потока: один направляется на кювету сравнения, а второй на рабочую кювету. Потоки, выходящие из кювет, затем направляются на один и тот же детектор. Двухлучевые приборы удобны при автоматической регистрации спектров поглощения, так как их не нужно перенастраивать при изменении длины волны. Детекторы излучения бывают двух типов: сурьмяно-цезиевый (186-650 нм) и кислородно-цезиевый (600-1100 нм) фотоэлементы. Спектрофотометрия является на сегодняшний день одним из самых широко применяемых и наиболее разработанных инструментальных методов анализа. К её достоинствам следует отнести достаточно высокую чувствительность, универсальность, простое аппаратурное оформление, возможность автоматизации анализа и т.д. В спектрофотометрии используются следующие приёмы анализа: прямая фотометрия (основанная на измерении собственного поглощения вещества); определение, основанное на проведении фотометрических реакций (сюда же относится и так называемая экстракционная фотометрия); дифференциальная фотометрия; многоволновая фотометрия; производная спектрофотометрия; а также фотометрическое титрование.

1. Прямая фотометрия.

Используется для определения веществ, обладающих достаточно интенсивным собственным поглощением. В прямой фотометрии измеряют оптическую плотность раствора веществ при длине волны, соответствующей максимальному поглощению, и далее одним из способов определяют концентрацию вещества в растворе. Прямая фотометрия обычно используется для анализа матриц относительно простого состава, в которых отсутствуют вещества, обладающие таким же характером поглощения, что и определяемое вещество, либо мешающие компоненты можно легко отделить в процессе пробоподготовки.

2. Определение, основанное на проведении фотометрических реакций.

Значительно чаще в фотометрии, особенно в случае определения неорганических веществ, обладающих незначительным собственным поглощением, измерению оптической плотности предшествует проведение химической реакции, в которой образуется новое вещество, обладающее более интенсивным поглощением:

В основе получения окрашенных продуктов могут лежать реакции комплексообразования (в том числе и с органическими реагентами), окислительно-восстановительные реакции, различные реакции с участием функциональных групп органических соединений и т.д. К фотометрическим реакциям предъявляют следующие основные требования: чувствительность, контрастность, надёжность и избирательность. Разберём каждое из этих требований, предъявляемых к реакциям используемых в фотометрии более подробней.

Чувствительность - реакция считается высокочувствительной, если величина кажущегося молярного коэффициента поглощения превышает .

Контрастность - разность между длинами волн, соответствующим максимумам поглощения реагента и продукта реакции должна быть как можно больше. При этом реакция считается высококонтрастной, если .

Надёжность - независимость протекания реакции от незначительных изменений условий её проведения, а также от присутствия в растворе других веществ.

Избирательность - в реакцию должно вступать только определяемое вещество или, по крайней мере, незначительная группа веществ.

Иногда проведение фотометрической реакции совмещается с экстракцией образующегося продукта несмешивающимся с водой растворителем. Такой гибридный метод анализа называется экстракционной фотометрией. Экстракционную фотометрию используют в тех случаях, когда продукт фотометрической реакции оказывается малорастворим в воде или определению мешают другие сторонние вещества, присутствующие в растворе.

3. Дифференциальная (разностная) фотометрия.

На воспроизводимость результатов фотометрических измерений влияют такие факторы как погрешности приготовления раствора, его мутность и флуоресценция, кюветные погрешности (использование кювет разной толщины, невоспроизводимость положения кювет в кюветодержателе), сигнал фона, погрешности установки длины волны, а также погрешности самого спектрофотометрического измерения, связанные с неисправной работой и погрешностями показаний самого прибора. При этом измерение слишком малых или слишком больших значений оптической плотности или пропускания погрешность измерения будет значительно увеличиваться. В спектрофотометрическом методе анализа существует целый ряд приёмов, которые были специально разработаны для того, чтобы расширить диапазон определяемых концентраций и уменьшить погрешности измерения слишком больших величин оптической плотности и пропускания. Эти приёмы спектрофотометрического анализа получили название дифференциальной (разностной) спектрофотометрии. Известно три разновидности дифференциальной фотометрии: метод отношения пропусканий, метод анализа следов и метод предельной точности. При использовании метода отношения пропусканий, в качестве раствора сравнения используется раствор с известной концентрацией вещества, где и . Данный метод используется при анализе растворов, имеющих большую оптическую плотность. В методе анализа следов нижняя граница шкалы устанавливается по раствору контрольного опыта, а верхняя устанавливается по раствору с известной концентрацией и . При использовании метода предельной точности, нижняя граница шкалы устанавливается по раствору , а верхняя по . При этом между , и устанавливается неравенство вида . Зависимость между концентрацией вещества в анализируемом растворе и наблюдаемой оптической плотностью в методе отношения пропусканий описывается формулой:

В методе анализа следов и методе предельной точности наблюдаемая величина оптической плотности нелинейно зависит от концентрации определяемого вещества, поэтому определение концентрации находится из градуировочного графика.

4. Многоволновая спектрофотометрия (метод Фирордта).

Данный приём спектрофотометрического анализа используется в том случае, если в растворе присутствуют несколько поглощающих веществ. В основе метода Фирордта лежит закон аддитивности оптических плотностей. Действительно, пусть в растворе присутствуют два или несколько компонентов. Оптическая плотность этого раствора при длине волны , , , …, очевидно, будет равна:

Составим систему из n -уравнений:

………………………………………………………………

где - молярные коэффициенты поглощения данных веществ при данных длинах волн, которые определяются заранее для растворов индивидуальных веществ. Решив данную систему n- уравнений, можно найти неизвестные концентрации:

т.е. если в растворе присутствуют n- поглощающих веществ, то для расчёта их концентрации необходимо будет решить n- уравнений, для чего потребуется измерить оптическую плотность не менее чем при n- длинах волн. Для решения подобных систем существуют математические подходы, рассмотрение которых выходит за рамки тематики данной работы. Метод Фирордта может быть использован лишь в том случае, если поглощение всех веществ, входящих в состав смеси, а также смеси в целом подчиняется основному закону светопоглощения.

5. Производная спектрофотометрия.

Данный метод основан на тех же принципах, что и обычная спектрофотометрия, однако, аналитическим сигналом здесь служит не оптическая плотность, а её производная n- го порядка (обычно по длине волны). Первая производная полосы поглощения описываемой законом нормального распределения, имеет два пика - положительный, соответствующий максимальной скорости увеличения оптической плотности, и отрицательный, соответствующий максимальной скорости уменьшения оптической плотности. Максимум оптической плотности находится в точке пересечения первой производной с нулевой линией. Аналогичный вид имеют и другие производные нечётного порядка. Контур второй производной и других производных чётного порядка похож на исходный спектр, но имеет меньшую ширину. Полуширина пика второй производной в 3 раза меньше полуширины исходной полосы поглощения, полуширины пика четвёртой производной - в 5 раз.

Дифференцирование спектра позволяет более чётко определить положение поглощения; суживает полосы поглощения и позволяет определять вещества, поглощающие при близких длинах волн, исходные спектры которых частично накладываются друг на друга; уменьшает систематические погрешности определения, связанные с наличием неучитываемого фонового сигнала.

6. Фотометрическое титрование.

Фотометрическим титрованием называется группа титриметрических методов анализа, в которых конечную точку титрования обнаруживают по изменению оптической плотности раствора. Фотометрическое титрование, в отличие от титрования с визуальным обнаружением конечной точки, может быть использовано для анализа разбавленных, окрашенных, мутных растворов, а также в том случае, когда изменение окраски раствора в конечной точке титрования плохо воспринимаются глазом.