Клонирование с помощью приборов

В последнее время все большую популярность приобретают микроманипуляторы- приборы, позволяющие под визуальным контролем стерильно перенести одну выбранную клетку из одного культурального планшета в другой. Этот метод особенно удобен, если в лунке с положительно протестированным супернатантом имеется несколько клонов. Прибор позволяет взять из всех, даже самых маленьких клонов по несколько клеток и рассадить их по одной в лунки. Налицо экономия культуральной посуды и ростовых сред.

Другим прибором, использующимся для клонирования, является упомянутый выше проточный цитофлуориметр. Он может предложенную ему суспензию клеток рассадить по одной клетке в лунки культурального планшета.

НАРАБОТКА ГИБРИДОМНЫХ КЛЕТОК И СЕКРЕТИРУЕМЫХ ИМИ АНТИТЕЛ

Наиболее широко используются сейчас два способа наработки гибридомных клеток и моноклональных антител: наработка на культуральных средах в СО2 инкубаторе и в асцитных жидкостях мышей (или крыс). Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.

НАРАБОТКА НА КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕДАХ В СО2 ИНКУБАТОРЕ

После того, как отобраны стабильно продуцирующие клоны, переходят к наработке антител, чтобы получить достаточное их количество для более подробного изучения их свойств. Гибридомные клетки очень чувствительны к перемене условий их содержания, поэтому необходима плавность и постепенность при увеличении объема ростовой среды и культуральной посуды: из одной лунки 96-луночного планшета клетки рассевают на несколько лунок такого же планшета, затем, когда плотность клеток в них будет достаточно большой, клетки из нескольких лунок переносят в одну лунку большего размера и т.д. Когда количество клеток будет достаточным для производства требуемых количеств антител, содержание эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в ростовой среде постепенно или резко снижают (до концентрации <1%). Рост и деление клеток при этом сильно замедляется, клетки переключаются на секрецию антител. Супернатанты клеток стерильно отбирают, проверяют на содержание специфичных антител и собирают для дальнейшей очистки.

Для наработки антител в промышленных масштабах используют различные приспособления (цитокультиваторы, ферментеры и т.д.), в которых соблюдаются необходимые условия культивации клеток (температура, уровень СО2 и влажности), а также частично или полностью автоматизированы подача питательных сред и отбор супернатантов.