Использование проточного цитофлуориметра

Проточный цитофлуориметр позволяет отсортировывать клетки, которые несут на своей поверхности флуоресцентную метку. Использование проточного цитофлуориметра для отбора гибридных клеток состоит в следующем: Смесь иммунных лимфоцитов и клеток миеломы подвергают стандартной процедуре слияния; затем полученную суспензию клеток инкубируют с раствором антигена, против которого хотят получить монАТ, предварительно конъюгированного с флуоресцентной меткой (например, ФИТЦ- флуоресцеинизотиоцианат). В-лимфоциты и гибриды лимфоцит+миелома имеют на своей поверхности молекулы иммуноглобулинов. В том случае, когда эти иммуноглобулины направлены против требуемого антигена, происходит связывание несущих их клеток с антигеном, а через него с флуоресцентной меткой. Затем с помощью прибора отсортировывают меченые клетки от всех остальных и получают популяцию клеток, состоящую в основном из гибридом, секретирующих антитела против желаемого антигена, и неслившихся В-лимфоцитов, не способных к делению.

Достоинства этого метода селекции по сравнению с методом селективных сред состоят в следующем:

а) отбираются не все гибриды лимфоцит+миелома, а только те, которые секретируют антитела к нужному антигену;

б) партнеры для гибридизации могут не быть мутантами (ГФРТ негативными), поэтому этот метод селекции особенно полезен при получении биспецифических антител, когда для слияния берут две гибридомы, секретирующие антитела разной специфичности.

Недостатки метода:

а) далеко не все лаборатории имеют в своем распоряжении этот весьма дорогостоящий прибор, требующий к тому же квалифицированного оператора;

б) процедура гибридизации довольно травматична для клеток, а дополнительные манипуляции с ними после гибридизации неизбежно приведут к большей их гибели.

КЛОНИРОВАНИЕ ГИБРИДОМ

Сразу после обнаружения в лунке с растущим клоном (или несколькими клонами) желаемых антител, нужно возможно скорее провести клонирование. Причины, по которым нужно торопиться с клонированием, такие же, что и для раннего тестирования первичных клонов, и были перечислены выше.