Использование селективных сред

Считается неплохим результатом гибридизации, когда сливается одна пара клеток из 10 000. Для удаления неслившихся миеломных клеток (неслившиеся В-лимфоциты отмирают сами через несколько дней) чаще всего используют негативную селекцию на селективных средах, смысл которой заключается в следующем: В клетках млекопитающих имеется два пути синтеза пуринов (предшественников нуклеотидов)- основной и запасной. Для осуществления запасного пути требуется фермент гипоксантинфосфорибозилтрансфераза (ГФРТ), который отсутствует у миеломных клеток. Линии миеломных клеток, пригодные для гибридомной технологии, имеют мутацию, в результате которой клетки не способны синтезировать ГФРТ и осуществлять запасной путь синтеза пуринов. Отбор мутантов и удаление спонтанно возникающих нормальных миеломных клеток производят с помощью 8-азагуанина или 6-тиогуанина. В-лимфоциты, как изначально нормальные, способны использовать оба пути синтеза пуринов.

После процедуры гибридизации клетки высевают в среде, содержащей аминоптерин, который блокирует основной путь синтеза пуринов. В результате неслившиеся клетки миеломы (и гибриды миелома+миелома) погибают, так как оказываются лишенными и основного (блокированного аминоптерином) и запасного (потерянного в результате мутации) путей синтеза пуринов. Способными к росту оказываются лишь гибриды миелома+лимфоцит, взявшие у исходных лимфоцитов способность к осуществлению запасного пути синтеза пуринов.

После отмирания основной массы неслившихся клеток ростовую среду постепенно заменяют на свежую, не содержащую аминоптерин, так как он мешает нормальному функционированию клеток.