Ферментных препаратов

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорганизма(выращенного любым способом), так и из других природных источников весьма трудоёмкая и дорогостоящая процедура. Поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко применяют коммерческие препараты ферментов, частота которых составляет всего 0,1% (т. е. 99,9% составляют примеси). К таким отраслям относятся сельское хозяйство, спиртовая, кожевенная, текстильная промышленность, производство бытовой химии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивоварении, представляет собой высушенную биомассу плесневых грибов. В большинстве отраслей пищевой промышленности и особенно в биотехнологии используют только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобождённые от балластных веществ и полностью охарактеризованные в отношении их специфичности и физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных. Из них готовят препараты различной степени очистки.

Ферментные препараты получают:

1. Путём высушивания в мягком режиме культуры микроорганизмов вместе с остатками питательной среды;

2. Путём упаривания экстракта из культуры продуцента, выращенного поверхностным способом;

3. Путём глубинного выращивания микроорганизмов, т. е. из фильтрата культуральной среды;

4. Путём применения метода ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10° С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты.

Препараты ферментов представляют собой либо высушенные до порошкообразного состояния продукты, либо жидкие концентраты, характеризующиеся 50% - м содержанием сухой массы веществ.

Для выделения фермента из клеточного содержимогонеобходимо очень тонкое измельчение исходного материала путём разрушения клеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др. Они имеют в своём составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют:

- Специальные мельницы и гомогенизаторы;

- Ультразвук;

-Метод попеременного замораживания и оттаивания ткани.

Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях исключающих денатурацию белка (нейтральное значение рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений).

Пример, иллюстрирующий получение очищенного препарата β-галактозидазы из мутанта E. coli, представлен на рис. 10.4.

Схема очистки включает отделение клеток микроорганизма при выходе их из ферментёра с культуральной жидкостью посредством центрифугирования и последующее разрушение клеток в гомогенизаторе высокого давления.

Рис.10.4. Технологическая схема непрерывного получения

β-галактозидазы

1 - стерилизатор среды; 2 - ферментёр; 3, 7 - центрифуги;

4 - гомогенизатор; 5 - теплообменник; 6 - смесительные камеры;

8 - ротационный вакуум фильтр

Для освобождения белков и нуклеиновых кислот полученный гомогенат обрабатывают сульфатом марганца до конечной концентрации этой соли в смеси, равной 0,05М. Осадок нуклеиновых кислот отделяется с помощью ротационной вакуум-фильтрации. Вся процедура очистки энзима от момента подачи бактерий в систему до момента получения осадка β-галактозидазы занимает всего 1 час.

В производственных условиях активность получаемого ферментного препарата оценивается количеством субстрата преобразованного 1 кг (1 мг) препарата при оптимальных условиях за 1 мин, и измеряется в Е/мг, моль/мг белка.

Очищенные ферментные препараты хранят при низкой температуре - до -80°С. Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для промышленного применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды (глюкоза, сахароза, лактоза), отдельные аминокислоты и желатину.

В настоящее время из 2003 включённых в список известных в настоящее время ферментов более 1500 выделено и в той или иной степени очищено. Это служит базой для дальнейшего изучения физико-химических основ их химического производства на промышленном уровне.