Из аспарагиновой кислоты

В процессе приготовления питательной среды для культивирования производственных штаммов ауксотрофных мутантов, обладающих способностью к сверхсинтезу аминокислоты лизина, в качестве источника углерода обычно используют смеси, включающие уксусную кислоту и свекловичную мелассу, в качестве источника азота – соли аммония. Мочевину, кукурузный экстракт, гидролизаты дрожжей.

Кроме дефицитных аминокислот, которые не синтезируются клетками мутантов, в питательную среду также добавляют необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов макро и микроэлементы (Р, Mg, Fe, Ca, Mn) и витамины (витамины группы В, биотин).

В процессе культивирования микроорганизмов обеспечивается подача стерильного воздуха при помощи специальных турбинных мешалок. Для предотвращения вспенивания субстрата и клеточной суспензии в среду культивирования добавляется пеногаситель.

Этапы процесса ферментации:

1. Посевной материал, предназначенный для производственной ферментации, вначале выращивают в посевных аппаратах при 28-32°С; рН 7-7,2 в течение 18-24 ч;

2. Затем полученная суспензия клеток подаётся в производственные ферментёры ёмкостью 50-100 м³, в которых поддерживается постоянный режим аэрации, необходимое давление. Осуществляется контроль за всеми компонентами и параметрами среды. Время ферментации 55-72 ч;

3. Накопление в культуральной жидкости лизина начинается после 25-30 ч выращивания промышленной культуры и к концу ферментации достигает 40-50 г/л.

4. Культуральную жидкость отделяют от культуры клеток продуцента фильтрованием и используют для получения препаратов лизина.

На основе промышленной культуры синтезирующих лизин бактерий организовано производство нескольких видов товарной продукции (рис. 12.5).

А) Жидкий концентрат лизина (ЖКЛ).

Б) Сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ);

В) Очищенные кристаллические препараты для пищевой и медицинской промышленности.

Жидкий концентрат лизина получают путём упаривания культуральной жидкости на вакуумной установке до концентрации сухого вещества 40%. Для предотвращения деградации лизина в процессе нагревания в культуральную жидкость добавляют бисульфит натрия и соляную кислоту до рН 4,5-5,0, в результате чего образуется соль – монохлоргидрат лизина.

В процессе получения сухого кормового концентрата лизина ЖКЛ высушивают горячим воздухом на распылительной сушилке при температуре 90⁰ С до влажности препарата 6-8%. Высушенный таким образом препарат содержит 15-20% монохлоргидрата лизина, 15-17% белков, 14% других аминокислот, витамины группы В, минеральные вещества.

В целях снижения гигроскопичности препарата в него добавляют наполнители: костную муку, негашёную известь, пше -

ничные отруби.

Рис. 12.5. Схема работы линии по производству лизина:

1 - подогрев и растворение свекловичной мелассы; 2 - смешивание кукурузного экстракта, питательных солей и мела в волной суспензии; 3 - нагревательная колонка; 4 - выдерживатель; 5 - теплообменник для охлаждения; б - аппараты для размножения и стерилизации посевной культуры; 7 - подача посевного материала; 8 - система фильтров для очистки и стерилизации воздуха; 9 - ферментер для выращивания промышленной культуры; 10 - фильтры экологической очистки выходящих газов; 11 - получение монохлоргидрата лизина; 12 - подача в реактор соляной кислоты, бисульфита натрия; 13 - монохлоргидрат лизина; 14 - подогрев культуральной жидкости, содержащей монохлоргидрат лизина; 15 - выпарная установка; 16 - сборник жидкого концентрата лизина (ЖКЛ); 17 - смешивание ЖКЛ с наполнителем; 18 - распылительная сушилка; 19 - подача горячего воздуха; 20 - отделение частиц сухого концентрата лизина от воздуха; 21 - экологическая очистка воздуха перед сбросом в атмосферу; 22 - приемник сухого кормового концентрата лизина (ККЛ).

Чаще всего в качестве наполнителя используют отруби, которые добавляют в ЖКЛ после упаривания. Полученную в результате тщательного перемешивания пасту высушивают на вальцово-ленточной сушилке и гранулируют. Гранулированный препарат ККЛ негигроскопичен, содержит 7-10% лизина.

Для получения очищенного высококонцентрированного препарата лизина:

-культуральную жидкость после фильтрования подкисляют соляной кислотой до рН 1,6-2,0;

- Образовавшийся в результате взаимодействия с соляной кислотой раствор монохлоргидрата лизина направляется на колонки с катионитом, где происходит отделение её от культуральной жидкости;

- Затем производится десорбция аминокислоты путём добавления 0,5-5% - м раствором аммиака;

- Далее производится упаривание под вакуумом при 60⁰ С до концентрации сухого вещества 30-50%, после чего подкисленный соляной кислотой раствор монохлоргидрата высушивается и используется как кормовой концентрат;

- Кристаллизацией полученной соли производят препарат лизина с содержанием монохлоргидрата 97-98%.

В процессе производства лизина кроме основного продукта полезное применение находят также побочные продукты и отходы. Так, после отделения культуральной жидкости в осадке остаются клетки бактерий продуцентов, фосфаты и другие компоненты питательной среды, которые после их высушивания могут быть использованы в качестве кормовой белковой добавки.

С другой стороны, технологические стоки и промывные воды после выделения монохлоргидрата лизина, содержащие в растворённом состоянии аминокислоты и остаточный лизин упаривают, а затем высушивают до влажности 10%, в результате получают кормовой препарат с высоким содержанием белков (40%) и незаменимых аминокислот.

Микробиологический синтез триптофана. Наряду с лизином разработаны промышленные технологии получения кормовых и высокоочищенных препаратов другой незаменимой аминокислоты – триптофана. Для производства этой аминокислоты применяется как одноступенчатый синтез при помощи бактериальных ауксотрофных мутантов с нарушенной регуляцией, так и двухступенчатый синтез, включающий вначале получение предшественника триптофана, а затем его ферментативное превращение в конечный продукт – триптофан.

У бактерий и других организмов аминокислота триптофан образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпиро-виноградной кислоты через ряд последовательных реакций, включающих образование шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшественником триптофана в процессе его синтеза является антраниловая кислота (рис. 12.6).

Рис. 12.6. Синтез триптофана, фенилаланина и тирозина

Синтез указанных в схеме аминокислот ингибируется конечными продуктами, которые действуют на ферменты, катализирующие начальные этапы превращений, связанные с образованием хоризмовой кислоты.

Из схемы видно, что для смещения метаболических реакций по пути образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую. Такое блокирование достигается действием мутагенных факторов. У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих превращение хоризмовой кислоты в префеновую, наблюдается повышенный синтез аминокислоты триптофана, однако для нормального развития этих мутантов в питательную среду необходимо добавлять дефицитные аминокислоты – фенилаланин и тирозин в количествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов синтеза триптофана.

Для промышленного получения незаменимой аминокислоты триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов бактерии Bacillus subtilis с нарушенным синтезом фенилаланина и тирозина. Все технологические процессы организованы примерно по такой же схеме, как и получение лизина при помощи мутантов коринебактерий. Ферментация длится 48 ч при 37°С, концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает 10 г/л. После отделения культуральной жидкости от клеток бактерий она упаривается и усушивается при 110-120°С. Высушенный продукт называют кормовым концентратом триптофана (ККТ).

Перед получением высококонцентрированных препаратов триптофана культуральную жидкость подвергают дополнительной очистке в восемь этапов:

1.Вначале её подкисляют соляной кислотой до рН 1,0;

2.Затем центрифугированием отделяют образовавшийся осадок;

3.Центрифугат, содержащий триптофан, пропускают через ионно-обменные колонки с катионом, в результате чего происходит связывание аминокислоты и выделение её из культуральной жидкости;

4.После промывки колонок производится десорбция триптофана 5% - м раствором аммиака;

5.Элюат направляется в вакуумный выпариватель, после чего проводится кристаллизация аминокислоты при 4-8°С;

6.Выделенная в кристаллическом виде соль триптофана промывается этанолом и высушивается под вакуумом при 60°С;

7.Высушенный кристаллический препарат содержит не менее 99% триптофана в виде хлорида;

8.Осадок после отделения культуральной жидкости, содержащий клетки культуры бактерий, также высушивают и используют как высокобелковую кормовую добавку, содержащую, кроме того, повышенное количество триптофана.

В России синтез триптофана производится по двухступенчатой схеме. Вначале методом химического синтеза получают предвестник триптофана – антраниловую кислоту, которую затем с участием ферментов микробного происхождения превращают в триптофан.

Процесс биотехнологического превращения

антраниловой кислоты в триптофан:

- На первой стадии наращивается биомасса дрожжей, являющихся продуцентами ферментов;

- Питательная среда для выращивания дрожжей готовится из свекловичной мелассы, мочевины и минеральных солей;

- Ферментация продолжается втечение 24 ч при 30°С;

- Далее в ферментер вводят спиртовой 5%-й раствор антраниловой кислоты и 50%-й раствор мочевины.

- Через 3-4 ч после добавления антраниловой кислоты в ферментёр дополнительно подаётся углеродный субстрат – меласса в виде 25%-го раствора.

- На последующих этапах ферментации периодически подаётся антраниловая кислота и мочевина через каждые 6 ч и раствор мелассы – через каждые 12 ч.

- Длительность ферментации около 120 ч, а с учётом времени наращивания биомассы дрожжей 144 ч. Содержание триптофана в культуральной среде составляет 0,3-0,5%, или примерно 6 г/л. После упаривания и сушки получают кормовой концентрат триптофана (ККТ), содержащий 90% сухого вещества, 48-54% белков, 1-3% триптофана, 1,5-1,9 мг% витамина В₁, 2,5-3,3 мг% витамина В₂, 62-68 мг% витамина РР.