2015-04-30
885
Наиболее популярен, хотя требует высокой квалификации и дорогостоящего оборудования.
Достоинства: быстрота и надежность
Этапы метода:
1) Донорных мышей самок скрещивают с самцами-производителями
2) Через 12 часов выделяют оплодотворенные яйцеклетки и помещают их в культуру
3) В один из пронуклеусов инъецируют очищенную клонированную ДНК
4) Ооциты, пережившие инъекцию, возвращают в естественную среду
5) Трансгенных животных идентифицируют, используя специфичную ПЦР и гибридизационный анализ
6) Первичных трансгенных животных скрещивают для получения трансгенных линий. Всех детенышей анализируют до получения гомозиготных линий
Недостаток: от 5 до 15% трансгенных вставок в гомозиготном состоянии летальны, то есть не всегда удается получить гомозиготные линии.
Точный механизм, обеспечивающий интеграцию рекДНК в хромосомы клетки-хозяина, неизвестен. Установлено, что в 70% случаев интеграция ДНК происходит до первого цикла репликации ДНК. Остальные 30% животных обнаруживают ту или иную степень мозаичности. Обычно имеется только один участок интеграции трансгена, в то же время количество его копий в геноме сильно варьирует и может достигать нескольких тысяч. Участок интеграции случаен.
|
|
|
3) Эмбриональные стволовые клетки (ЕS-клетки)
ЕS-клетки – это клетки, полученные из бластоцисты, которые можно культивировать in vitro и после необходимых манипуляций вернуть в организм, инъецируя в бластоцисту.
Трансгены вводят в бластоцисту либо путем трансфекции, либо инфицируя их рекомбинантными ретровирусами.
Преимущества: возможно проводить селекцию трансформированных клеток по определенным параметрам (число копий трансгена, его локализация, характер экспрессии)
Все полученные таким образом организмы мозаичны, то есть состоят из содержащих и не содержащих трансген клеток. Для преодоления этой проблемы трансформированные ЕS-клетки используют в качестве доноров ядер, которые способны колонизировать энуклеированные ооциты.
Ретровирусы
Достоинства: не требует дорогостоящего оборудования, несложная процедура.
Недостаток: часто формируется организм, мозаичный по числу и локализации вирусных встроек в клетки
Этапы метода:
1) Эмбрионы на стадии морулы (восьмиклеточный организм) освобождают от яйцевой оболочки и помещают в среду с фибробластами, продуцирующими рекомбинантный ретровирус
2) Инфицированные эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты, вводят самке
