Экспрессия ген-эквивалентов эукариотических полипептидов в клетках E. Coli

Ген-эквивалент – это последовательность ДНК, кодирующая зрелую форму полипептида.

Часть активных полипептидов, таких как нейропептиды или гормоны, обычно синтезируются в виде предшественников, имеющих большую молекулярную массу. В результате специфического процессинга образуется зрелый полипептид и низкомолекулярный пептид. В бактериальной клетке для большинства полипептидов правильный процессинг из пре-белка невозможен. В этих случаях в бактериальной клетке необходимо клонировать последовательность ДНК, кодирующую уже зрелую форму полипептида.

Пример

Ген-эквивалент соматостатина человека синтезируют химическим методом и встраивают в векторные плазмиды, содержащие фрагменты lac-оперона E. coli. Если синтетический фрагмент встраивали по сайту EcoRI в конце гена β-галактозидазы, синтезировался химерный белок, содержащий последовательности как большей части β-галактозидазы, так и соматостатина. Соматостатин высвобождают из химерного белка, обрабатывая его бромистым цианом.

Таким образом, суть разработанного метода заключается в следующем:

1) искусственный ген встраивается внутрь структурного гена, кодирующего определенный бактериальный белок

2) Инициация синтеза РНК и белка происходят на регуляторных участках бактериального оперона, а терминация трансляции – на нонсенс-кодонах синтетического гена

3) Экспрессия гибридного гена приводит к появлению химерного белка, содержащего аминокислотную последовательность бактериального белка и пептида, кодируемого синтетическим фрагментом ДНК

4) Целевой пептид выщепляется из состава химерного белка специфическим химическим или ферментативным гидролизом.

Этот подход использовался для микробиологического синтеза инсулина человека.

Инсулин в клетках человека синтезируется в виде препроинсулина. Это препгормон, который синтезируется на мембраносвязанных рибосомах и содержит сигнальный пептид, обуславливающий секрецию белка из клетки. В процессе секреции сигнальный пептид отщепляется от молекулы. Образующийся в результате проинсулин представляет собой сложную трехмерную структуру с тремя дисульфидными мостиками. Из середины проинсулина выщепляется 35 аминокислот (С-цепь), образуя А- и В-цепи, связанные дисульфидными мостиками, обеспечивающими стабильность четвертичной структуры зрелого белка.

Этапы микробиологического синтеза инсулина:

1) химическим путем синтезируются гены А и В-цепи инсулина

2) Синтезированные фрагменты встраиваются в структурную часть гена антранилсинтетазы в составе векторной плазмиды в правильной рамке трансляции

3) Из образовавшихся химерных полипептидов бромистым цианом выщепляется последовательность А и В-цепей

4) А и В-цепи смешиваются и химически генерируются дисульфидные связи

Таким же способом в 1981 г. был синтезирован лейкоцитарный интерферон человека, а в 1983 г. – иммунный интерферон.