2015-04-30
784
У бактерий транскрипция большинства генов регулируется с помощью системы белков-репрессоров и активаторов, которые влияют на взаимодействие РНК-полимеразы с транкрибируемыми генами. В генной инженерии экспрессия клонированных генов также должна регулироваться, поскольку при избыточной экспрессии продукты экспрессии могут оказывать токсическое действие на бактерии. Для этого конструируют системы, в которых экспрессия клонируемых генов подавлена (репрессирована) на ранних фазах роста культур и дерепрессирована в нужный момент времени.
Рассмотрим две такие системы. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют систему регуляторных элементов лактозного оперона, в другом – систему промотор-репрессор-оператор фага λ.
В векторы вводятся регуляторные последовательности фага λ и lac -оперона, за которыми следуют полилинкеры с несколькими уникальными сайтами рестрикции. В тот же вектор вводится ген-регулятор, кодирующий белок-репрессор. В отсутствие индуцирующего воздействия репрессор связывается с оператором, препятствуя взаимодействию РНК-полимеразы с промотором, под контролем которого находится клонированный ген. Это приводит к резкому снижению уровня транскрипции этого гена и, соответственно низкому содержанию белкового продукта. Для индукции экспрессии в случае с lac- опероном используют синтетический аналог природного индуктора (алло-лактозы) – изопропил-β-D-тиогалактопиранозид. Индуктор связывается с молекулой репрессора и нарушает его взаимодействие с оператором. lac -промотор становится доступным для РНК-полимеразы, которая начинает транскрибировать гены, расположенные за промотором.
|
|
|
В системе репрессии –дерепрессии фага λ используют ген репрессора, содержащий температурочувствительную мутацию. Мутантный белок –репрессор сохраняет способность подавлять синтез РНК только при температуре (28-30ºС). При повышении температуры до 42ºС происходят инактивация белка-репрессора и репрессия генов, расположенных под контролем соответствующих промоторов.
Для обеспечения регулируемой тканеспецифической экспрессии рекДНК в соматических клетках животных и растений в составе векторов используют энхансеры, которые избирательно стимулируют транскрипцию в соответствующих тканях, клетки которых не экспрессируют необходимые регуляторные белки.
