Приготовление посевного материала для поверхностного культивирования микроорганизмов

Поверхностный способ применяют в основном при культивировании мицелиальных грибов. В этом случае посевной материал может быть приготовлен тремя способами:

1) в виде культуры, выращенной на твердой питательной среде;

2) в виде спорового материала;

3) в виде мицелиальной массы продуцента, выращенной на жидкой питательной среде глубинным способом.

Посевную культуру на твердой питательной среде готовят выращиванием микроорганизмов в возрастающем количестве в 3–4 этапа. Состав питательной среды определяется свойствами микроорганизма-продуцента. Чаще всего для этой цели используют увлажненные пшеничные отруби. Влажность среды после стерилизации должна составлять в зависимости от вида продуцента 35–65%. Для рыхлости к отрубям иногда добавляют древесные опилки, солодовые ростки, свекловичный жом.

На первом этапе приготовления посевного материала исходную культуру продуцента пересевают в пробирку с 1,0–1,5 г стерильных отрубей и выращивают при оптимальной температуре до обильного спорообразования.

На втором этапе продуцент культивируют в тех же условиях и на той же среде в колбах емкостью 0,75–1,0 дм³, содержащих 40–100 г влажной среды (из одной пробирки засевают среду в 3–4 колбах).

На третьем этапе (дополнительный этап, при малом спорообразовании у продуцента) культивирование осуществляют в колбах с 300 г влажных отрубей до наступления обильного спорообразования.

На четвертом этапе полученный посевной материал используют для засева посевных кювет. Кюветы прямоугольной формы размером 600×400 мм и высотой борта 20–30 мм выполнены из сплошного листа оцинкованного железа, снабжены крышками с одним или двумя отверстиями, которые закрываются ватно-марлевыми подушками. Вместимость посевных кювет 400–500 г воздушно-сухих отрубей. Питательную среду стерилизуют в автоклаве в биксах по 2 кг при давлении 0,15 МПа в течение 1 ч, а посевные кюветы – в стерилизационных шкафах при температуре 120–130°С в течение 2,0–2,5 ч.

Содержимым одной колбы засевают 20 посевных кювет. Посевной материал смешивают с питательной средой в отдельной емкости с соблюдением всех правил асептики и раскладывают в кюветы слоем толщиной 0,8–1,2 см. Между кюветой и крышкой укладывают слой непроклеенной бумаги для предотвращения возможной конденсации влаги на крышке и создания зон излишнего увлажнения растущей культуры. Кюветы со средой помещают на стеллажи в растильные камеры, в которых поступающим через кондиционер воздухом поддерживается определенный режим по влажности и температуре. Камеры заполняют кюветами исходя из удельной нагрузки по культуре 1–2 кг засеянной среды (по сухой массе) на 1 м³ объема камеры. При этом обмен воздуха в камере должен быть равен 2-3 объемам камеры за 1 ч.

Готовый посевной материал снимают с кювет и во влажном состоянии помещают в стерильные пакеты, которые затем хранятся при температуре 3–4°С. Длительность хранения посевного материала не должна превышать 5–6 суток (влажная культура подвержена лизису и активность ее снижается). При необходимости более длительного хранения посевной материал подсушивают до влажности 10–12% в растильной камере воздухом при температуре 28–30°С, предварительно сняв крышки с кювет. Приготовленный посевной материал представляет собой спороносящую культуру продуцента и должен содержать не менее 0,7 млрд спор в 1 г. Для получения засевной суспензии посевной материал смешивают в специальной емкости со стерильной водой. Суспензия используется для засева среды в производственных условиях.

Споровой материал отличается от спороносящей культуры незначительным содержанием самой питательной среды и состоит главным образом из спор продуцента при небольшом содержании мицелия. Споровой материалсодержит 7–10 млрд. спор в 1 г. Для получения спорового посевного материала поверхностную культуру подсушивают до влажности 9–10% и подают в вибросепаратор, из которого воздушным потоком (вакуум-насосом) конидии отделяются от среды и собираются в приемник. Споровой материал расфасовывают в полиэтиленовые пакеты в боксе-манипуляторе. Полученный таким образом конидиальный материал может храниться без значительных изменений при температуре 8–24°С до 1,5 лет. За год хранения конидии теряют всхожесть в среднем на 8%.

Споры (конидии) обладают свойством гидрофобности, плохо смачиваются водой. Это приводит к неравномерности засева среды и, следовательно, к неодинаковой скорости роса культуры. Однородную суспензию конидий можно получить добавлением в воду на каждый грамм спорового материала 25–50 см³ ПАВ (алкилбензолсульфата). При этом смачиваемость спор сильно возрастает при неизменной всхожести.

Применение спорового материала облегчает технологический процесс, позволяет более полно механизировать его. Однако получение спорового посевного материала приводит к сильному загрязнению воздуха конидиями. Несмотря на наличие аспирационных устройств, насыщенность воздуха конидиями может достигать 3·10²–1·10⁴ на 1 м³, что недопустимо в санитарно-гигиеническом отношении. Это приводит к необходимости применять специальную одежду и индивидуальные средства защиты. Чтобы исключить возможность проникновения посторонней микробиоты, в помещениях цеха чистой культуры поддерживается подпор воздуха (р_изб. = 0,01–0,02 МПа).

Наиболее безопасным является способ получения посевного материала глубинным культивированием в виде мицелиальной массы. Отличие этого способа от рассмотренных состоит в том, что культура, выращенная в колбах на отрубях, поступает для засева жидкой питательной среды в лабораторных ферментаторах объемом до 40 дм³. Продолжительность культивирования обычно составляет 24–30 ч. Молодая, активно растущая мицелиальная масса служит посевным материалом для засева производственной среды. Такой способ позволяет в 2,5–3,0 раза сократить длительность приготовления посевного матерала, в 4–5 раз уменьшить площадь отделения чистой культуры, улучшить условия труда, снизить спорообразование в готовой производственной культуре.