Защита с помощью ферментов

Фридович и МакКорд в 1968г впервые показали, что ранее открытый белок гемокупреин (эритрокупреин) способен катализировать превращение супероксидных радикалов в Н₂О₂. СОД клеток высших животных и человека состоит из двух субъединиц, содержащих 1 атом меди и 1 атом цинка (Cu, Zn – СОД). Кроме Cu, Zn – СОД существует и Mn-СОД, содержащая в активном центре ион Mn³⁺. Mn-СОД обнаружена в E.coli и др. бактериях, а также в тканях высших организмов – листьях гороха, печени крысы, печени человека. Активности марганцевой и медной СОД близки по величине. Cu,Zn-CОД локализована в цитозоле клеток, а в митохондриях обнаружена Mn-содержащая СОД. В организме животных СОД присутствует практически во всех органах и тканях. Наиболее высокая активность обнаружена в эритроцитах, печени, мозге, почках, щитовидной железе. Клетки E.coli содержат также и Fe-СОД. Молекула Fe-СОД обычно имеет две субъединицы и содержит 1-2 атома Fe³⁺ . Константа скорости дисмутации, катализируемой Fe-СОД, немного ниже, чем у других типов СОД. Кроме E.coli Fe-СОД можно обнаружить и в др. бактериях.

Реакция, катализируемая СОД:

2О₂ ^·- + 2Н⁺ ® Н₂О₂ + О₂

Активность СОД обычно оценивают с помощью методов, в которых СОД тормозит появление окрашенного продукта, образующегося в реакции с О₂^-. Источником О₂^- - радикалов в таких исследованиях обычно служат системы: ксантин + ксантиноксидаза, Феназинметосульфат + НАДН. За единицу активности СОД в отличие от других ферментов принимается такое количество СОД, которое тормозит в 2 раза восстановление цитохрома с при концентрациях ксантиноксидазы (0,003 ед/мл), ксантина (2 мкмоль/ мл) и цитохрома с (0,6 мкмоль/ мл). Считают, что основным регулятором активности СОД в клетке является уровень О₂ ^·-, который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего фактора. Причем индукция СОД при повышении генерации О₂ ^·- связана с усилением синтеза фермента в клетке de novo.

Помимо СОД реакцию дисмутации супероксидного радикала может осуществлять медьсодержащий белок – церулоплазмин (ЦП). Это один из основных регуляторов обмена меди в организме. ЦП обычно относят к транспортным белкам. Вместе с тем, у ЦП хорошо выражена оксидазная каталитическая активность, которая связана с особенностями его структуры, с содержанием меди в молекуле (на медь приходится 0,27-0,32% от всей массы белка); апо-церулоплазмин не обладает оксидазной активностью. ЦП in vitro окисляет большое количество разнообразных по химическому строению веществ: адреналин, диоксифенилаланин, аскорбиновую кислоту, хиноны, двухвалентное железо и многие др. В связи с этим, ряд авторов относят ЦП к ферментам, хотя при этом противоречиво указывают его положение в системе классификации ферментов. В этой связи, мы говорим о церулоплазмине, освещая ферментативное звено АОС, хотя, по-видимому, более правильно относить ЦП к транспортным белкам. В отличие от СОД, защтщающей внутриклеточные структуры, ЦП функционирует в крови, где и перехватывает свободнорадикальные формы кислорода, предохраняя таким образом от их повреждающего действия липидсодержащие биоструктуры. Связывание супероксидных радикалов ЦП протекает с участие пары ионов меди. При этом происходит четырехэлектронное восстановление кислорода до воды, а не до пероксида водорода, как это происходит с участием СОД. Однако эффективность ЦП в отношении связывания супероксиданиона примерно в 100 раз ниже, чем у СОД. Несмотря на это в настоящее время большинством исследователей ЦП рассматривается в качестве основного эндогенного антиоксиданта плазмы крови. Особенностью этого белка является его высокая устойчивость к токсическому действию АФК, что позволяет ему сохранять биологическую активность в условиях интенсивной генерации АФК. Неспецифическая АОА ЦП обусловлена образованием прочных комплексных соединений с медью. Ряд авторов связывает АОА ЦП с окисленным состоянием ионов меди. В то же время другие авторы считают, ионы Cu не являются обязательным первичным акцептором электронов окисляемого субстрата. ЦП синтезируется клетками печени на мембраносвязанных рибосомах и выходит их клеток печени не в результате их гибели, а секретируется ими. При этом содержание меди в гепатоцитах не влияет на экспрессию гена ЦП и его биосинтез, а включение меди во вновь синтезируемый ЦП не является лимитирующим этапом ы его биосинтезе и секреции из гепатоцитов. Помимо антиокислительных функций ЦП участвует в транспорте ионов Cu, мобилизации сывороточного железа для кроветворения, регуляции уровня биогенных аминов в сыворотке крови.

Вторым звеном защиты от АФК служат ферменты, удаляющие Н₂О₂: каталаза и пероксидазы. В клетках животных и растений каталазная активность сосредоточена в пероксисомах, которые содержат также ферменты, образующие Н₂О₂: глюкозооксидазу, уратоксидазу и флавопротеин дегидрогеназу. Определение активности каталазы обычно сводится к определению скорости разложения Н₂О₂.

Реакция, катализируемая каталазой:

2 Н₂О₂ ® 2 Н₂О + О₂

Молекула каталазы состоит из 4-х одинаковых субъединиц и содержит 4 гемовых группы на одну молекулу фермента. Каталаза присутствует практически во всех тканях организма, но наибольшая каталазная активность обнаружена в эритроцитах, печени, почках.

Другая группа ферментов, способных Н₂О₂ из биологических сред – это пероксидазы, из которых особо следует остановиться на GSH-пероксидазе. Этот фермент широко распространен в тканях животных и растений. GSH-пероксидаза из клеток печени состоит из 4-х субъединиц, каждая из которых содержит в активном центре атом селена. В клетках печени GSH-пероксидаза локализована в цитозоле и матриксе митохондрий. Таким образом, Н₂О₂, образующаяся при работе пероксисомальных ферментов, удаляется содержащейся в пероксисомах каталазой, а Н₂О₂, образующаяся в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме, разрушается преимущественно под действием GSH-пероксидазы. Помимо селенсодержащей глутатионпероксидазы в организме животных обнаружена глутатионпероксидаза, не содержащая селена. Она имеет другие физико-химические и каталитические свойства. В отличие от Se-содержащей ГПО, активно катализирующей превращение Н₂О₂ и органических гидроперекисей, не содержащая селена ГПО обладает субстратной специфичностью только к органическим гидроперекисям. Полагают, что не содержащая селена ГПО идентична ферментам семейства глутатио-S-трансфераз, которые в большей степени связаны с детоксикацией продуктов ПОЛ, генерирующихся в эндоплазматическом ретикулуме при метаболизме ксенобиотиков. Видовые т органные особенности активности селеннезависимой ГПО, в частности, значительное превалирование ее активности в печени у большинства животных над активностью Se-содержащей ГПО, указывают на явную антиоксидантную функцию селеннензависимой ГПО и, по-видимому, могут объяснить относительную толерантность некоторых видов животных к дефициту селена.В целом антиоксидантный эффект глутатионпероксидаз в цепи ПОЛ, инициируемого АФК, заключается в том, что они предотвращают продолжение ПОЛ, во-первых, обезвреживая уже образовавшиеся гидроперекиси жирных кислот, во-вторых, предупреждая их образование путем расщепления Н₂О₂, которая, как отмечалось, реагируя с супероксидным анион-радикалом, генерирует радикал гидроксила, чрезвычайно активно окисляющий органические молекулы всех типов.

Действие глутатионпероксидазы сопряжено с функционированием глутатионредуктазы, обеспечивающей восстановление глутатиона за счет НАДФН. Глутатион, представляющий собой трипептид - g-глутамилцистеинилглицин, играет роль восстановленного кофактора в глутатионпероксидазной реакции:

O O

çç çç

Н₃N⁺-CH-CH₂-CH₂-C-NH-CH-C –NH-CH₂-COO^-

½ ç

COO^- CH₂

ç

SH

Глутатион (GSH)

В присутствии глутатионпероксидазы и Н₂О₂ сульфгидрильные группы двух молекул глутатиона взаимодействуют с образованием дисульфида глутатиона (GSSG).

O O

çç çç

Н₃N⁺-CH-CH₂-CH₂-C-NH-CH-C –NH-CH₂-COO^-

½ ç

COO^- CH₂

ç

S

ç

S

ç

O CH₂ O

çç ç çç

Н₃N⁺-CH-CH₂-CH₂-C-NH-CH-C –NH-CH₂-COO^-

½

COO^-

Дисульфид глутатиона (GSSG)

Для реставрации восстановленного глутатиона с помощью реакции, катализируемой глутатионредуктазой, необходим НАДФН:

GSSG + HAДФН + Н⁺ ® 2GSH + HAДФ⁺

Из-за низкого сродства фермента к глутатиону активность GSH-пероксидазной системы существенно зависит от концентрации GSH, а следовательно, от активности глутатионредуктазы и уровня НАДФН в клетке. Последний определяется активностью пентозофосфатного пути, а также активностью некоторых ферментов, обеспечивающих альтернативное продуцирование НАДФН (например, НАДФ-изоцитратдегидрогеназа). Так, для обеспечения потребности в эритроцитах в восстановленном НАДФ до 10% от общего потребления глюкозы может быть метаболизировано через пентозофосфатный путь. У людей мутация гена, кодирующего глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (первый фермент пентозофосфатного пути), может приводить к гемолитической анемии, сопровождающейся усиленным гемолизом эритроцитов. Клинические проблемы возникают в том случае, когда эти люди принимают некоторые лекарственные препараты (например, антималярийный препарат примахин), что приводит к высокому уровню пероксидов. В данной ситуации потребность в НАДФН начинает превосходить возможности мутантных клеток метаболизировать глюкозу через пентозофосфатный путь. В легких, глазах и мышцах активность этих систем меньше, чем в других органах и тканях, что затрудняет контроль за концентрацией АФК и может приводить к развитию патологических процессов.

В настоящее время в качестве агентов ферментативной АОС также рассматривают глутатионтрансферазы и недавно обнаруженную фосфолипидгидропероксид-глутатионпероксидазу. Глутатионпероксидаза восстанавливает Н₂О₂ и органические гидропероксиды ROOH свободных жирных кислот, нуклертидов, нуклеиновых кислот и, вероятно, белков. Глутатиотрансферазы восстанавливают только ROOH, но важно, что один из изоферментов находится прямо в хроматине и восстанавливает ROOH ДНК в ядре. Фосфолипидгидропероксид –ГПО восстанавливает ROOH жирных кислот в составе фосфолипидов (для этого не требуется предварительный гидролиз последних). Вспомогательным ферментом также является глутатиоредуктаза.