Выделение нейтрофилов в двойном градиенте плотности фиколл-урографина

Принцип метода. Для предотвращения активации нейтрофилов во время выделения рекомендуется проводить все манипуляции при 4 °C. Используют фиколл-урографин ρ = 1,077 г/см³ и ρ = 1,119 г/см³. Вначале создают двойной градиент фиколл-урографина: первым в пробирку вносят раствор фиколл-урографина, имеющий плотность ρ = 1,119 г/см³, затем на него аккуратно наслаивают раствор фиколла с плотностью ρ = 1,077 г/см³. Гепаринизированную кровь наслаивают на двойной градиент фиколл-урографина, центрифугируют 45 мин при 400 g. После центрифугирования получают кольца мононуклеарных клеток (верхнее) и нейтрофилов (нижнее), а в осадке находятся эритроциты. Полученное кольцо мононуклеарных клеток в зависимости от характера эксперимента удаляют или отбирают в чистую центрифужную пробирку и отмывают культуральной средой. Нейтрофильное кольцо отбирают и переносят в чистую пробирку, содержащую среду, свободную от ионов Ca²⁺ и Mg²⁺. Клетки дважды отмывают, центрифугируя 10 мин при 200 g. Присутствующие эритроциты можно лизировать. Для уменьшения примеси эритроцитов и повышения доли нейтрофилов нужно вначале проинкубировать гепаринизированую кровь с 6% раствором декстрана и затем полученную взвесь клеток наслоить на двойной градиент фиколл-урографина (получают два кольца клеток, см. выше) или на одинарный градиент плотности фиколл-урографина (ρ = 1,077 г/см³). В последнем случае нейтрофилы присутствуют в осадке вместе с эритроцитами, которые впоследствии лизируют. При использовании обоих вариантов метода содержание нейтрофилов в полученной клеточной суспензии составляет около 95% (рис. 2.3, см. также цв. вклейку).