2015-04-20
590
Кроме описанного «хромового» теста, существуют методики оценки клеточной цитотоксичности с использованием проточного цитофлуориметра. В данном случае для мечения клеток используют два реагента. Сначала метят КМ флуорохромом, который проникает в клетки, не повреждая их, и флуоресцирует, возбужденный лазерным излучением. Затем к КМ добавляют КЭ, инкубируют их совместно, чтобы дать возможность реализоваться киллерной атаке, и добавляют к смеси второй реагент, превращающийся во флуорохром только в живых клетках под действием их ферментов-эстераз. В результате в итоговой картине КЭ станут светиться одним цветом «живого флуорохрома», живые КМ будут двухцветными, погибшие КМ - одноцветными по первому флуорохрому.
Известен метод оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности с использованием в качестве КМ эритроцитов (например, барана), покрытых IgG- антителами к ним. КЭ, несущие Fc-рецепторы к IgG, разрушают (лизируют) КМ, и по уровню освобождаемого в культуральную среду гемоглобина судят об активности таких киллеров (NK, В-клетки, моноциты, макрофаги и др.).
|
|
|
Определение перфорина методом ELISPOT
Белок перфорин является необходимым компонентом лизиса, осуществляемого ЦТЛ и NK-клетками для уничтожения КМ. Метод ELISPOT (см. гл. 4) широко применяется для определения выработки цитокинов антигенспецифическими Т-клетками. Метод ELISPOT достаточно чувствителен для выявления перфорина после активации ЦТЛ соответствующими антигенными эпитопами, например вирусными (потенциально годен для использования любой эпитоп). При выполнении данного метода на дне лунки пластикового планшета фиксируются монАТ к перфорину. Недостаток метода - отсутствие возможности определить фенотип клеток, секретирующей перфорин, что частично компенсируется обогащением фракции ЦТЛ магнитной сепарацией. В экспериментах с использованием иммуномагнитной сепарации показано: основную популяцию клеток, образующих «пятна», составляют CD8+
Т-лимфоциты (80-90%).
