Лабораторная работа 3-5

Получение супернатанта, содержащего цитокины и другие биологически активные молекулы из моноцитов периферической крови человека

1. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколлверографина. Затем клетки ресуспендируют в среде RРМI 1640, содержащей 2-меркаптоэтанол (5×10^-5 М), с конечной концентрацией 1 х10⁶ клеток в 1 мл.

2. В каждую лунку 24-луночного планшета помещают 1 мл клеточной взвеси МНК и инкубируют в течение 60 мин при 37 °С для получения фракции прилипающих моноцитов. Надосадочную жидкость, содержащую лимфоциты, удаляют.

3. В опытные лунки с прилипшими моноцитами добавляют ЛПС (E. coli), растворенный в RРМI 1640 до конечной концентрации 10 мкг/мл, а в контрольные лунки - равный объем среды RРМI

1640.

4. Через 24 ч культивирования при 37 °С в атмосфере 5% СО₂ проводят центрифугирование при 400 g в течение 8 мин при комнатной температуре; надосадочную жидкость, содержащую цитокины, собирают, стерилизуют фильтрованием (0,2 мкм) и хранят при -20 °С.

5. Супернатант, полученный таким способом, можно использовать для определения концентрации различных цитокинов (провоспалительных, противовоспалительных, колониестимулирующих факторов (КСФ) и др.), секретируемых МНК. Оценку цитокинов проводят методами биологического тестирования (см. гл. 7) или ИФА (см. гл. 4). Кроме того, можно определять содержание оксида азота, противомикробных пептидов и других биологически активных молекул.