Заливка

Глава 1

· Методы и маркёры

Арсенал методов гистологии, эмбриологии и цитологии включает разнообразные (наряду с классической гистологической техникой) методы исследования структуры и функции клетки, применяемые в молекулярной и клеточной биологии. В этой главе дан краткий обзор этих методов и различных маркёров, применяемых для идентификации различных клеток.

Гистологическая техника

Основные типы материала для микроскопии — гистологические срезы (например, печени, лёгких), мазки (например, крови, красного костного мозга), сколы, смывы. Мазки подразделяют на мазки–отпечатки (например, слизистой оболочки щеки для определения телец Барра), ПАП–мазки (в гинекологической практике), сколы, смывы. В любом случае материал для исследования сначала фиксируют, затем обезвоживают, далее заливают в твёрдые среды, затем готовят срезы и производят окраску.

ФИКСАЦИЯ

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путём их химического сшивания.

Фиксирующая жидкость

Быстрое проникновение химического фиксатора в живую ткань — условие сохранности структур in situ. Наиболее распространённые фиксаторы — формалин, спирты, глутаральдегид. Небольшие кусочки ткани фиксируют, помещая их в раствор фиксатора. Целые органы перед выделением перфузируют, т.е. прокачивают фиксатор через сосудистую систему органа.

Криофиксация

Лучшую сохранность структур обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (–196 °C).

Лиофилизация

Материал как для световой, так и для электронной микроскопии подвергают быстрому замораживанию, прекращающему метаболические процессы. Последующее высушивание в вакууме вызывает возгонку льда. Метод позволяет исключить обработку ткани в промежуточных средах (обезвоживание и заливка).

ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

Обезвоживание готовит фиксированную ткань к проникновению в неё сред для заливки. Вода живой ткани, а также вода фиксирующих смесей (большинство фиксаторов — водные растворы) после фиксации должна быть полностью удалена. Стандартная процедура удаления воды — обезвоживание в спиртах возрастающей от 60° до 100° крепости.

ЗАЛИВКА

Заливка — необходимая процедура, предваряющая приготовление срезов. Заливка делает ткань прочной, предотвращает её раздавливание и сминание при резании, даёт возможность получить тонкие срезы стандартной толщины. Наиболее распространённая среда для заливки — парафин. Используют также целлоидин, пластические среды и смолы.