В сыворотке крови

В клинической лабораторной диагностике этот метод основан на определении креатина (по количеству накапливающегося неорганического фосфата) или на учёте образования креатинфосфата.

Кинетические методы базируются как на прямой, так и на обратной реакциях, однако предпочтение отдают второй – с использованием креатинфосфата и АДФ в качестве субстрата. Так, метод Ганцера и Гильверга основан на спектрофотометрическом измерении скоростей сопряжённых ферментативных реакций:

Креатин + АТФ креатинфосфат + АДФ;

креатин(фосфо)киназа

АДФ + фосфоенол-ПВК АТФ + ПВК;

пируваткиназа

ПВК + НАДН + Н⁺ лактат + НАД⁺.

лактатдегидрогеназа

Современные кинетические методы исследования активности КФК, реализуются с помощью наборов реагентов известных фирм «Эббот», «Хоффманн-Ла Рош», «Кормей», «Эко-Мед-Полл».

Спектрофотометрический метод Оливера включает использование вспомогательного и индикаторного энзимов:

Креатинфосфат + АДФ креатин + АТФ;

креатинфосфокиназа

АТФ + глюкоза глюкозо-6-фосфат + АДФ;

гексокиназа

НАД⁺Ф НАДФН+Н⁺

Глюкозо-6-фосфат 6-фосфоглюконат

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

Из приведённых схем видно, что КФК катализирует реакцию переноса фосфатного остатка с креатинфосфата на АДФ. В результате синтезируется АТФ, который используется в следующей реакции – фосфорилировании глюкозы. Глюкозо-6-фосфат окисляется с участием НАД⁺Ф, который является коферментом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Скорость образования НАДФН при λ=340 нм пропорциональна активности креатинкиназы.

Согласно методике Розальски, к приготовленному на трис-буфере (рН 6,8) раствору креатинфосфата, содержащего также АДФ, хлорид магния, глюкозу, НАД⁺Ф и АМФ, добавляют вспомогательные ферменты: гексокиназу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. Смесь преинкубируют при выбранной температуре (25˚С или 37˚С), затем вносят сыворотку крови и после «лаг-периода» (от 5 до 20 мин) регистрируют при 340 нм увеличение оптической плотности раствора. Активность рассчитывают, исходя из микромолярного коэффициента поглощения НАДФН.