Мрачный диагноз

После статей о структуре ДНК в апрельском номере Nature Розалинда ушла из Кингз-колледжа, где пережила столько неприятных минут. На новом месте она занялась изучением вируса табачной мозаики (ВТМ). Со свойственной ей дотошностью Франклин исследовала все физико-химические особенности РНК и белков этого вируса. Результаты ее пятилетней работы имели столь важное значение, что на их основе возникла новая наука – молекулярная биология.
Когда ей объявили страшный диагноз, она не испугалась, потому что искренне верила: пока болезнь развивается, наука найдет средство борьбы с ней. Она проходила курс химиотерапии в Кембридже, фактически поселившись в доме Крика, с семьей которого сдружилась после 1953 года. Но и научную работу, и свой маленький коллектив она не оставляла. Последний раз Розалинда Франклин появилась в своей лаборатории за три недели до смерти.
В конце марта 1958 года ей пришлось лечь в больницу. Излюбленной темой ее бесед была модель вируса табачной мозаики, которую должны были выставить на Всемирной выставке в Брюсселе.
16 апреля выставка открылась. В тот же день Розалинда Франклин умерла. Ей было неполных 38 лет.

X. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ

В настоящее время стало очевидным, что достижения в области молекулярной биологии способны сильно изменить практическую медицину. Они не только углубили наши знания об экспрессии генов и причинах многих болезней, но способствовали разработке новых подходов к их диагностике и лечению.

Было установлено, что полиморфизм генов широко распространён в популяции людей, показана взаимосвязь между изменениями в структуре ДНК и многими болезнями. Идентификация генов, нарушение работы которых приводит к развитию наследственных заболеваний, создала предпосылки для подробного анализа генетических и биохимических основ патогенеза этих заболеваний и разработки наиболее эффективных методов лечения.

Методами молекулярной медицины были созданы вакцины для предотвращения гепатитов, инсулин человека - для лечения сахарного диабета, фактор VIII - для восстановления нормального свёртывания крови и лечения гемофилии и многие другие препараты.

С помощью генной терапии оказалось возможным вводить в организм больного полноценно работающие гены и таким образом восстанавливать метаболические нарушения, вызванные мутантными генами. Таким путём осуществляется лечение детей с иммунодефицитом, вызванным дефектом аденозиндезаминазы, в стадии клинических испытаний находятся методы гено-коррекции таких наследственных болезней, как семейная гиперхолестеринемия, гемофилия В, му-ковисцидоз и некоторые другие.

Для выявления дефектов в структуре ДНК она должна быть выделена из соответствующего источника (биологической жидкости, биоптата, культуры клеток и т.д.) и "наработана" в количествах, достаточных для исследования. Для генно-терапевтических работ необходимы выделение нормальных генов и введение их в дефектные клетки таким образом, чтобы они экспрессировались, позволяя восстановить здоровье пациента.

В настоящем разделе будут даны основные представления о методах, используемых в решении проблем ДНК-диагностики наследственных болезней и генной терапии.

А. Методы выделений ДНК

ДНК может быть выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, ферментативное разрушение белков протеиназами и экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа. Затем ДНК осаждают, как правило, этанолом и после удаления надосадочной жидкости растворяют в буферном растворе.

• Оценку качества экстрагированной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения, т.е. при 280 и 260 нм, соответственно. Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей, полученных при 260/280 нм, должно быть больше 1,8.
• Молекула ДНК одной хромосомы среднего размера содержит 150х106 пар нуклеоти-дов и имеет длину около 4 см. Молекулы такого размера чувствительны к механическим воздействиям, возникающим в растворе в процессе выделения, и часто фрагментируются. В ходе выделения получают молекулы ДНК значительно меньше исходных, но всё равно очень большие - тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их приходится дополнительно фрагментировать.