Смотреть описание в конце лабораторной работы

При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящихся в камере, соответствует расчетному. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой.

Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камерыубивают нагреванием или суспендированием в 0,5%-ном водном растворе формалина. Число клеток подсчитывают с объективом 8х или 40х. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую сторону квадрата. При подсчете количество кпеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом - 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток повторяют 3-4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Число клеток N в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

N =a 10³ n / h S, (5)

где N - число клеток в 1 мл суспензии;

а - среднее число клеток в квадрате сетки;

h - глубина камеры в мм;

S - площадь квадрата сетки в мм²;

10³ - коэффициент перевода см³ в мм³;

п - кратность разведения исследуемой суспензии.

4.2 Оценка эффективности термической стерилизации

Разлить исходную суспензию микроорганизмов по 3-5 мл в пробирки. Примечание: в качестве точки отсчета оставить нулевую пробу.

Поместить пробирки в термостат (или на водяную баню) при температуре 65 °С.

Отбирать пробы через определенные промежутки времени (15 минут) в течение часа.

Определить число клеток в пробах с использованием метода простого окрашивания и подсчета в счетных камерах Горяева-Тома.

По полученным данным построить зависимость N=f(τ)), где N - число клеток в объеме проб микробной суспензии.

Вычислить удельную скорость гибели микроорганизмов К из уравнения

K = 1/ τ ln (N₀/N), (3)

Согласно описанному выше, выполнить эксперименты при других температурах (85 и 100 °С).

Построить графическую зависимость в координатах In К= f(1/T) (Т в градусах Кельвина) (рис. 3.2). Из графика найти tgά и точку пересечения с осью ординат.

1пК А

1пА

Рис.

5.2 Графическая зависимость K от 1/T

В линеаризованном виде уравнение Аррениуса (4) Может быть записано как

ln K = ln A- E/RT (5)

Здесь ln А определяется из графика как величина, численно равная величине отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат, а E/R – tgά.

Таким образом, значение удельной скорости гибели определяется из уравнения Аррениуса с найденными константами — А и E/R.

Эффективность стерилизации может быть оценена для любой температуры: так как А, Е, R – постоянные величины, подставив в уравнение Аррениуса (4) любое значение Т, рассчитывается К.

Зная N_o и задав N, из уравнения K = 1/ τ ln (N₀/N) легко найти τ.

Далее следует определить Тю - 2,303/Л" - время, за которое концентрация выживших клеток уменьшится в 10 раз.

Сделать обобщающие выводы по полученным экспериментальным данным и результатам расчетов.

Существует несколько методов непосредственного микроскопического счета микроорганизмов. Подсчет проводится либо в специальных счетных камерах, либо в микроскопических препаратах.

Внимание! Ошибкой методов подсчета микробов под микроскопом является учет не только живых, но и мертвых клеток. Ограничение методов – необходимость высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

Счетные камеры применяются для счета микроорганизмов относительно крупных размеров – дрожжей, спор грибов и крупных бактерий, которые можно обнаружить при микроскопировании оптическими системами со сравнительно малым увеличением.

Счетные камеры бывают разных конструкций (Тома, Горяева, Бюркера и др.), но принцип их устройства один и тот же. Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные плоские площадки (рис. А).

А

Б

В

Рис.7. Счетная камера Горяева: А – вид сверху; Б – вид сбоку; h – высота камеры;

В – вид сетки при малом увеличении микроскопа

Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка для подсчета микроорганизмов. Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней (рис. Б). Эти площадки служат для притирания покровного стекла. Таким образом, если прикрыть стеклянную пластинку с сеткой покровным стеклом так, чтобы оно легло на боковые пластинки, то пространство между покровным стеклом и пластинкой с сеткой будет представлять собой камеру глубиной 0,1 мм, дном которой является сетка. Сетка разделена на большие и маленькие квадраты (рис. В): площадь большого квадрата равна 1/25 мм², малого – 1/400 мм². А так как слой жидкости над сеткой имеет высоту 0.1 мм, то объем жидкости над большим квадратом будет равен 1/250 мм³, а над малым – 1/4000 мм³.

Для подсчета микробных клеток углубление с сеткой закрывают шлифованным покровным стеклом, тщательно притирают его, а затем пипеткой вносят через бороздку камеры исследуемую суспензию. Только при таком порядке работы объем взвеси микробов, находящихся в камере, соответствует расчетному. Число клеток подсчитывают с объективом 8^х в десяти больших и двадцати малых квадратах и определяют среднее число клеток в одном квадрате. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии высчитывается по формуле:

где M – число клеток в 1 мл суспензии;

a – среднее число клеток в квадрате сетки;

h – глубина камеры, мм;

S – площадь квадрата сетки, мм²;

10³ – коэффициент перевода мм³ в см³ (мл);

n – разведение суспензии (если оно применялось).

Например, при подсчете взвеси дрожжей в камере Горяева обнаружено 15 дрожжевых клеток в одном малом квадрате. Густая взвесь была предварительно разведена 1: 100:

В практике микробиологических исследований нередко достаточно приблизительной оценки степени обсемененности продукта микроорганизмами. В таких случаях, например при исследовании мяса и рыбы, проводится прямое микроскопирование (бактериоскопия) продукта или приготовленного из него высушенного и окрашенного препарата. О степени обсемененности продукта микроорганизмами судят по их количеству в поле зрения микроскопического препарата. Микроскопирование позволяет установить характер микрофлоры (бактерии, дрожжи, плесени), соотношение между отдельными группами бактерий (кокки, палочки).

Микроскопические исследования широко применяются при оценке качества различных кисломолочных продуктов, пищевого уксуса, пива, прессованных хлебопекарных дрожжей. Эти исследования дают возможность выявить инфицирование продуктов посторонними микроорганизмами, не свойственными микрофлоре данных продуктов.

Преимущество прямых методов заключается в возможности сравнительно быстрого проведения количественного и качественного микробиологического исследования. Однако эти методы имеют существенный недостаток: при очень малом числе микробных клеток в исследуемом субстрате невозможно получить точные результаты. Кроме того, при подсчете бактерий невозможно установить принадлежность их к той или иной физиологической группе, а при применении общепринятого метода Виноградского (метод счета на фиксированных мазках) отличить живые клетки от мертвых.