Мы уже несколько раз упоминали это заболевание раньше. Было показано, что по многим признакам CS можно рассматривать как один из большой группы так называемых транскрипционных синдромов, особенно когда речь шла о больных, генетически связанных с ХР. В тоже время синдром Коккейна во многих случаях не имеет никакой связи с ХР, и будет нами здесь представлен как независимое заболевание. Этот редкий синдром был описан в середине тридцатых годов Коккейном. Считается аутосомным рецессивным генетическим заболеванием, описан в семьях, часто проявляется в результате родственных браков.
Больные страдают карликовостью в результате задержки роста и развития с самого раннего возраста. Среди наиболее часто встречающихся признаков - фоточувствительность, глухота, атрофия зрительного нерва, удлиненные по отношению к туловищу конечности, большие уши и нос, глубоко запавшие глаза и ускоренное старение. Пациенты умирают в возрасте около 12 лет. В тех редких случаях, когда они доживают до 18-20 лет, у них в отличие от ХР нет выраженной предрасположенности к опухолям (как и у TTD). Необычная чувствительность этих больных к солнечному свету позволила сделать предположение о наличии дефекта в репарации УФ-повреждений ДНК. Фибробласты больных CS показывают резко пониженную выживаемость после УФ-облучения по сравнению с клетками здоровых доноров. Эта чувствительноть к ультрафиолету коррелирует с повышенной чувствительностью к химическим агентам, считающимся УФ-миметиками. Например, к N-ацетокси-N-2-ацетил-2-аминофлюорену или 4-нитрохинолину. Некоторыми авторами описана также и чувствительность к гамма-облучению. При этом обычно клетки больных синдромом Коккейна не чувствительны к гамма-миметикам (алкилирующим агентам в том числе).
|
|
При облучении клеток нормальных доноров ультрафиолетом мы наблюдаем немедленное подавление валового синтеза ДНК в степени, зависимой от дозы, а затем полное восстановление исходного уровня в течение 5-8 часов. В клетках больных синдромом Коккейна, как и больных пигментной ксеродермой, наблюдается явный дефект этого восстановления. В растущих клетках CS также наблюдается подавление синтеза РНК УФ-облучением, но восстановление идет несколько быстрее, чем в случае ДНК синтеза. Этот феномен дефектного восстановления синтеза РНК после УФ-облучения обычно используется как диагностический критерий для дискриминации синдрома Коккейна. Этот дефект коррелирует с наличием карликовости, умственной осталости и чувствительности к солнечному свету.
Больные синдромом Коккейна, как и пигментной ксеродермой, относятся к нескольким различным группам комплементации, основными среди которых являются две – А и В. При этом надо отметить, что те редкие случаи, когда мы наблюдаем признаки синдрома Коккейна у больных пигментной ксеродермой групп B, D и G, не относятся к этим двум группам комплементации, а рассматриваются отдельно и обозначаются как XPB/CS; XPD/CS и XPG/CS. Таким образом, к настоящему времени у синдрома Коккейна описано 5 различных групп комплементации.
|
|
Ген CSA клонирован и кодирует белок, относящийся к древней группе белков, часто называющихся семейством с WD-повторами, WD-40-повторами или GH-WD-повторами. Белки этого семейства не обладают какими-либо каталитическими свойствами, но способны служить передатчиками сигналов внутри клетки. Мне бы хотелось остановиться на них немного подробнее. Эти белки получили свое название из-за того, что внутри каждого белка имеется от 4 до 8 высококонсервативных аминокислотных последовательностей, содержащих от 23 до 41 аминокислот и фланкированных с одной стороны GH (Gly-His), а с другой - WD (Trp-Asp). Таких белков обнаружено 27 (CSA - 28-ой), причем функция 20 из них уже ясна, хотя бы приблизительно. Впервые WD-повтор был обнаружен в β-субъединице GTP-белка, или, как их теперь обычно называют, G-белка, который передает сигнал через плазматическую мембрану; и был назван β-трансдуцин-повтором. Этот белок усиливает связывание α-субъединицы G-белка с рецепторами гормонов и другими внутриклеточными сигнальными молекулами, способствуя объединению в тройной комплекс рецептора и G-α-β-γ. Эта способность G-β облегчать объединение различных белков и образование мультибелковых комплексов может служить ключом к пониманию функций и других белков, содержащих WD-повторы. Например, особая роль в объединении макромолекул во время сплайсинга мРНК (белок Prp4), модификации мРНК (белок CstF), транскрипции (TafII80; TUPI). Аналоги G-β субъединицы были описаны и у других организмов, включая дрожжи и диактиостилиум, и показали очень высокую степень консерватизма между последовательностями повторов, находящихся в одинаковом положении внутри белка (у G-β-белка этих повторов 5 и они обозначаются повтор 1 G, повтор 2 G и т.п.). Таким образом, мы видим, что эти белки сохраняют свои последовательности не менее 1 миллиона 200 тысяч лет, которые отделяют эволюционно человека от диктиостилиума и дрожжей. Подобная же картина наблюдается и в других группах WD-белков.
Таким образом, все описаные до сих пор группы белков с WD-повторами показывают крайне высокую степень эволюционного консерватизма, сравнимую только с таковой у гистонов (взаимодействующих с широким кругом различных белковых и ДНК-овых последовательностей) и кальмодулинов (взаимодействующих с большим числом несвязанных энзимов, регулирующих обмен ионов Са++). Из этого можно сделать вывод, что и у белков, содержащих WD-повторы, их функции были определены по меньшей мере более 1.200 миллиона лет назад. Способность же этих белков к многомерному связыванию с другими белками указывает на их значение в физиологическом объединении различных клеточных процессов.
Белок CSA содержит 396 аминокислот и имеет молекулярную массу приблизительно 44 кД. Ген, кодирующий этот белок, был картирован на 5 хромосоме - 5р14-р12. Этот белок образует комплекс с белком CSB и белком р44, входящим в состав того же самого транскрипционного комплекса TFIIH, что и белки XPB и XPD. Отвечает за это связывание N-конец белка, так как даже обрезанный CSA белок, содержащий только N-конец с 146 или 187 аминокислотными остатками был способен взаимодействовать и с CSB и с р44.
Ген, кодирующий белок CSB, был определен несколько раньше также с помощью функциональной комплементации чувствительности к ультрафиолету клеток одного из штаммов грызунов, дефектного по гену ERCC6. Он оказался способным исправлять клеточный фенотип клеток от больных CSB. Таким образом была доказана идентичность двух генов - CSB и ERCC6. У человека этот ген картирован на 10q11.2 и кодирует полипептид, содержащий 1493 аминокислоты с молекулярной массой около 169 кДа. Этот белок имеет несколько специфических областей. Например, последовательность между 356-394 аминокислотными остатками содержит 60% глутамина и аспаргина, включая 10 кислых остатков подряд. Подобные кислые районы были обнаружены во многих ядерных белках, связывающихся с хроматином или с гистонами. Наиболее интересной чертой этого полипептида является участок, содержащий около 400 аминокислот (527-950), в его середине. Этот участок охватывает согласованную группу нуклеотидов, высококонсервативную и характерную для обширного семейства белков, обозначаемых как SWI/SNF семейство. На сегодняшний день известно 29 членов этого семейства. Внутри каждого белка этого семейства тот самый участок приблизительно в 400 аминокислот состоит из очень консервативных коротких последовательностей аминокислот, прерываемых более протяженными менее консервативными последовательностями, которые варьируют по размерам у разных членов семейства. Вначале таким образом были описаны два суперсемейства ДНК и РНК геликаз. При более подробном исследовании этой гомологии, было выдвинуто предположение о существовании по крайней мере 8 подсемейств, одно из которых включает человеческий полипептид CSB и его дрожжевой гомолог Rad26. Другое подсемейство включает дрожжевой полипептид Swi2/Snf2, который является ДНК-зависимой АТФ-азой, входящий в состоящий из по крайней мере 11 субъединиц мультибелковый комплекс, вовлеченный в активацию транскрипци у дрожжей (SWI/SNF комплекс), и его гомологи у человека и дрозофилы. Третье подсемейство включает белок дрозофилы ISWI, который тоже является частью мультибелкового комплекса, называемого NUFR, принимающего участие в транскрипции. АТФ-азная активность комплекса предположительно связана с ISWI белком. Предполагают, что оба эти комплекса могут быть "молекулярными машинами", вызывающими активацию транскрипции с помощью механизмов, вовлеченных в ремоделирование хроматина. Вероятно, в суперсемействе SWI/SNF содержатся АТФ-азные субъединицы различных хроматин-ремодулирующих комплексов (каждому соответствует свое подсемейство SWI/SNF белков), основной функцией которых является нарушение структуры хроматина для различных операций с ДНК, не обязательно именно для транскрипции. Участие подобного хроматин-ремодулирующего комплекса в репарации ДНК выглядит вполне естественным. В белке CSB присутствует также и геликазный мотив, но данные о его геликазной активности пока экспериментально не подтверждены. CSB белок также имеет общие последовательности с фактором, связывающим транскрипцию и репарацию E.coli (TRCF). К настоящему времени сложилось представление, что CSB белок является функциональным гомологом TRCF и что он (по-видимому, вместе с белком CSA) играет особую роль в привлечении белков эксцизионной репарации в район остановившейся транскрипции и/или их взаимодействии с РНК-полимеразным комплексом. Об этом мы подробнее будем говорить при обсуждении пострепликативной репарации.
|
|
|
|
Существует много наблюдений, подтверждающих представление о сопряженном дефекте репарации и транскрипции при синдроме Коккейна. Во всех случаях, когда это заболевание диагностировалось, на клеточном и молекулярном уровне наблюдались мутации в генах, кодирующих белки либо прямо входящие в состав транскрипционного комплекса TFIIH, либо взаимодействующие с ним. К тому же все тяжелые симптомы этого заболевания невозможно объяснить только с точки зрения репарации ДНК, тогда как их реальной причиной могут быть сниженный уровень и нарушение последовательности транскрипции в онтогенезе.