Лабораторная работа № 2

"КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА НЕКОТОРЫЕ ФЕРМЕНТЫ"

Качественно ферменты можно обнаружить по их действию на те или иные субстраты.

Опыт №1. Определение пепсина.

Общие понятия.

Пепсин и химозин вырабатываются стенками желудка и ка­тализируют реакцию гидролиза белка до пептонов. Оба фермента действуют в сильно-кислой среде (рН=1,4 – 2,5). Активатором этих ферментов является соляная кислота.

Реактивы: пепсин 1% р-р.

Исследуемое вещество: молоко (белок молока).

Ход работы: В две пробирки наливают по 2 мл молока, затем и первую пробирку добавляют 5 капель пепсина, во вторую пробирку 5 капель предварительно прокипяченного и охлажденного пепсина. Обе пробирки помещают в баню при 37°. Через несколько ми­нут сравниваем содержимое пробирок.

Что наблюдаете? Сделайте вывод.

Опыт № 2. Реакции на тирозиназу.

Общие понятия.

Фермент тирозиназа относится к фенолооксидазам. Этот фермент катализирует окисление тирозина и других производных фенолов газообразным кислородом воздуха с обра­зованием красного пигмента галохрома, который затем превращается в темный пигмент, родственный меланинам.

Схематично катализируемый процесс можно изобразить следующим образом:

красный пигмент

Источником фермента могут быть растительные и животные ткани, например, ­сырой картофель, мышечная ткань, кровь и т.д.

Особенно много тирозина находится ближе к поверхности клубня.

Ход работы: 1 г сырого картофеля измельчают в ступке с 3 мл дистил­лированной воды и быстро фильтруют через марлю.

Фильтрат содержит тирозиназу. Полученную вытяжку делят на две части. Одну часть кипятят. Затем в обе пробирки добавляют по 5-10 капель 0,1% раствора тирозина и помещают их в штатив при комнатной температуре. Пробирки периодически встряхивают, чтобы усилить соприкосновение раствора с кисло­родом воздуха. Наблюдают изменения, происходящие в пробирках.

Сделайте вывод.

Опыт № 3. Реакция на сукцинатдегидрогеназу.

Реактивы: 1) янтарная кислота (нейтрализованная)

2) метиленовая синь

Исследуемое вещество: мышечная ткань.

Ход работы: 0,3 г. хорошо измельченной мышечной ткани растирают в ступке с двенадцатикратным количеством дистиллированной воды и отфильтровывают через марлю, не отжимая. Экстракцию мышеч­ной ткани повторяют еще раза два. После последней экстракции мышечную кашицу заливают водой и используют полученный раст­вор с кашицей.

В две пробирки помещают по 3-4 мл р-ра мышечной кашицы. В первую пробирку прибавляют около 0,5 мл нейтрализованного раствора янтарной кислоты. Затем в обе пробирки добавляют по 1 капле метиленовой сини, встряхивают и ставят на водяную баню при 37°С. Через некоторое время наблюдают обесцвечивание раствора в одной из пробирок. В какой?

Фермент сукцикатдегидрогеназа относится к анаэробным дегидрогеназам, классу оксидоредуктаз. Т.е. они участвуют в переносе водорода от окисляемого субстрата - янтарной кислоты - на какой-то промежуточный субстрат, в опыте таким промежуточным субстратом является метиленовая синь. Это фермент, коферментом которого является НАД, содержащий в качестве активного центра витамин РР. Схематично происходящие в пробирке процессы можно изобразить следующим образом:

Янтарная кислота фумаровая кислота

Опыт № 4. Определение каталазы.

Общие понятия.

В процессе тканевого дыхания в организме образуется не только Н₂О, но и Н₂О₂, которая является токсичным веществом и для ее устранения организм располагает ферментом, разруша­ющим перекись водорода на воду и кислород. Это фермент каталаза. Ее много содержится в крови, печени, молоке и в растительных продуктах.

Реактивы: Н₂О₂ – 3% раствор

Исследуемое вещество: кровь, печень, мышца и т.д.

Ход определения: В пробирку наливаем 1 мл 3% р-ра Н₂О₂ и добавляем немно­го растертой печени, мышцу или немного крови.

Что наблюдаете? Сравнение реакции.

Опыт № 5. Обнаружение пероксидазы.

Общие понятия.

Пероксидаза, фермент, который содержится во многих рас­тительных и животных продуктах. Содержится она в доброкачест­венных тузлуках. Этот фермент катализирует реакции окисления некоторых фенолов и аминов перекисью водорода или органичес­кими перекисями.

Реактивы: 1) р-р бензидина в спирте - 1% (свежеприготовленный)
2) Н₂О₂ – 3% раствор.

Исслед. в-во: тузлук, мышца рыбы, мясо и т.д.

Ход работы: Приготавливают 4 пробирки, так, как указано в таблице №4 (пр. 1,2,3,4).

Таблица №4

№ проб	Количество вещества каплями	Результат (окраска)
бензидин	тузлук	кипяч. тузлук	H2O	H2O2
			-	-
		-		-
		-	-
			-	-	-

Что наблюдаете? Дайте объяснение.

Бесцветное синее

Бензидин неокрашенное соединение. При окислении он прев­ращается в пара-дииминдихинон (п-дииминдихинон) синего цвета.