Специфичность действия амилазы и сахаразы. Содержание

1. Лабораторная работа № 1……….........................................……….....4

2. Лабораторная работа № 2……………………………………………..8

3. Лабораторная работа № 3……………………………………………..12

4. Лабораторная работа № 4……………………………………………..21

Тема: "СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ".

При выполнении данной работы вам понадобятся реактивы, яв­ляющиеся в той или иной степени токсичными - это СuSO₄, раст­вор Фелинга II, а также раствор Люголя (р-р J₂ в H₂O с добав­лением КJ). СuSO₄ и раствор Фелинга не летучи, из раствора Люголя J₂ может улетать. Все реактивы, в особенности раствор Люголя, не следует без надобности держать открытыми!

После работы с ними следует тщательно мыть руки.

Лабораторная работа № 1.

"ОБЩИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ"

Опыт №1: Влияние температуры на скорость реакции, ускоряемой ферментом.

Скорость реакций, идущих в присутствии неорганических катализаторов, возрастает с повышением температуры.

Так, крахмал быстро гидролизуется в присутствии соляной и разбавленной серной кислоты только при кипячении.

Наиболее благоприятной температурой для действия боль­шинства ферментов, находящихся в организме человека, является температура 35-40ºС. При повышении температуры фермент начина­ет денатурировать.

Понижение температуры ниже оптимума является причиной понижения реакционной способности молекул. В этом можно убедиться, исследуя действие амилазы слюны на крахмал при 0º, 37º, 100ºС.

Оборудование и реактивы:

1. Штатив с пробирками.

2. Воронка.

3. Стаканчик на 30 мл.

4. Водяная баня.

5. Чаша со льдом.

6. Крахмал – 0,1% раствор.

7. Р-р Люголя.

8. Амилаза слюны - готовится каждым студентом.

Ход работы: В стаканчик собирают слюну и разбавляют ее в пять раз дистиллированной водой. Если в растворе будут загрязнения, то фильтруют его через несколько слоев марли.

В три пробирки вносят по 10 капель разбавленной слюны и помещают их:

1- в кипящую баню

2- в баню при 37-40ºС

3- в баню со льдом

Через 5-7 минут во все три пробирки добавляют по 10 ка­пель крахмала, тщательно перемешивают содержимое каждой про­бирки и ставят в те же условия. Замечают время. Через пять минут пробирки вынимают из бань. Пробирку вынутую из кипя­щей бани, охлаждают под краном. Добавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора Люголя и отмечают результат.

Таблица №1.

субстрат катализатор	КРАХМАЛ
0º	37º	100º
амилаза

Как далеко прошел гидролиз в каждой пробирке? Сделайте вывод. Гидролиз крахмала протекает по схеме:

Каждый продукт реакции дает разное окрашивание с раство­ром Люголя.

Опыт №2: Специфичность действия амилазы и сахаразы.

Для изучения специфичности действия амилазы и сахаразы можно воспользоваться тем, что при гидролизе субстратов (крахмал, сахароза), на которых мы будем исследовать фермен­ты, образуются соединения, обладающие редуцирующими свойст­вами, т.е. дающие положительную реакцию Троммера. Фелинга, Толленса и др., в то время как исходные субстраты - крахмал, сахароза - этих реакций не дают, т.к. в их молекуле нет свободных гликозидных гидроксилов (карбонильной группы).

крахмал α-D-глюкоза (при полном гидролизе)

сахароза α,D-глюкоза β,D-фруктоза

Оборудование и реактивы:

1. Штатив с пробирками

2. Водяная баня

3. Сахароза 0,1% р-р свежеприготовленный

4. Крахмал 0,1% р-р свежеприготовленный

5. Сахараза

6. Амилаза

7. Реактив Фелинга I и II.

Можно использовать раствор амилазы, оставшийся от опыта №1.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ АМИЛАЗЫ.

Ход работы: Вносят в одну пробирку 10 капель раствора крахмала, во вторую 10 капель раствора сахарозы. В обе пробирки добавляют по 5 капель амилазы слюны и помещают пробирки в водяную баню при t =37-40ºС.

Через 10 минут пробирки вынимают, охлаждают, добавляют по 5-6 капель реактива Фелинга (3 капли раствора Фелинга I и 3 капли раствора Фелинга II).

Нагревают пробирки в пламени горелки. Отмечают результа­ты.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ САХАРАЗЫ.

Ход работы: В одну пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в другую 10 капель раствора сахарозы. Затем в обе пробирки добавляют по 5 капель сахаразы. Помещают пробирки в баню при 37-40°С на 10 минут. Затем вынимают их из бани, охлаждают и проводят реакцию Фелинга, так, как описано выше.

Результаты вносят таблицу № 2(полученная окраска).

Таблица №2.

РЕАКЦИЯ ФЕЛИНГА
субстрат фермент	КРАХМАЛ	САХАРОЗА
АМИЛАЗА
САХАРАЗА

Сделайте выводы.

Опыт №3. Влияние активатора и ингибитора на активность амилазы слюны.

Ход работы: В три пробирки наливают:

в первую - 10 капель Н₂О;

во вторую - 8 капель H₂О +2 капли 1% р-ра NаС1;

в третью - 8 капель Н₂О +2 капли 1% р-ра СuSO₄.

В каждую пробирку приливают по 10 капель слюны, разведен­ной 1:5, перемешивают, добавляют по 5 капель 0,5% р-ра крахма­ла, вновь перемешивают и оставляют при комнатной температуре.

Через 1-2 минуты в три пробирки с водой, подкрашенной каплей раствора йода, отливают по 2-3 капли содержимого каждой опытной пробирки.

Какую окраску приобретает содержимое каждой из пробирок? Если разницы в окрасках содержимого пробирок нет (все синие), опыт повторяют, увеличивая время выдержки.

Аналогично пробу берут через 1-2 минуты после взятия первой пробы. Результаты работы фиксируют в таблице №3.

Таблица №3.

№	фермент	субстрат	Время действия фермента (в мин.)	Окраска жидкости после добавления J2 в присутствии
NаС1	Н2О	СuSO4
	амилаза	крахмал	1-2
	амилаза	крахмал	2-4

Сделайте вывод.