Среда Петраньяни. К 150 мл цельного молока при помешивании добавляют 6 г картофельной муки, 1 г пептона и одну мелко изрезанную картофелину величиной с куриное яйцо. Смесь кипятят на водяной бане до образования клей. стера, охлаждают до 50 С, добавляют 4 куриных яйца и еще один желт перемешивают. Приливают 12 мл глицерина и 10 мл 20%-ного стерильного водного раствора малахитовой зелени и перемешивают. Фильтруют через два слоя и, разливают по пробиркам, скашивают и в таком положении стерилизуют в аппарате для свертывания сывороток при 850С в течение двух дней по 30 мин или один раз при 900С в течение 1 ч.
Для проверки стерильности пробирки со средой выдерживают в термостате 2 дня, после чего их закрывают резиновыми колпачками - во избежание подсыхания среды и хранят до употребления.
Среда Левенштейна - Йенсена. 1. Навески: одноосновного фосфата калия: 2,4 г, сульфата магния (MgS04• 7Н2О) 0,24, цитрата магния 0,6 г, l-аспарагина 3,6; глицерина х.ч. 12 г растворяют в указанной последовательности в 200 мл дистиллированной воды, доводят такой же водой объем раствора до 600 мл и стерилизуют текучим паром 2 ч. По охлаждении в него добавляют 30 г картофельного крахмала, растворяют при легком подогревании, разливают в колбы 150 мл выдерживают в кипящей водяной бане при постоянном помешивании до загустения. Затем стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.
2. 20 стер ильных свежих (диетических) яиц обрабатывают способом, указанных разделе Возбудитель туляремии, асептически выпускают их содержимое в литровую колбу с бусами, тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли на воронки. К 1 л яичной массы добавляют 2 %-ного стерильного раствора малахитовой зелени и осторожно перемешивают.
Крахмально-солевой раствор (600 мл) подогревают до 55-50 С и смешивают с яичной массой, избегая появления пузырьков воздуха, а если они появились, то выдерживают 1 ч до их исчезновения. Затем среду разливают асептично, в пробирки по 7-10 мл скашивают и в таком положении свертывают в аппарате для свертывания сывороток, как и среду Петраньяни.
Готовую среду выдерживают в термостате 48 ч для проверки стерильности. В среде на дне пробирок должно остаться немного конденсата. При его отсутствии в пробирки добавляют асептически по 0,5-1,0 мл 4%-ного раствора глицерина или 5%-ного раствора глюкозы, или физиологического раствора (растворы должны быть стерильны). Во избежание высыхания конденсата пробки пробирок парафинируют. Среду хранят при 2-60С не более 14 дней.
При небольшом расходе среды массу компонентов соответственно уменьшают.
Среда Гельберга. Состав: снятое молоко, картофельный отвар, солевой раствор, яйца, краска малахитовая зелень, лимонная кислота.
Подготовка компонентов:
Цельное молоко в стерильной посуде отстаивают сутки в холодильнике, удаляют сливки и разливают по 110 мл в колбы. Стерилизуют текучим паром дважды, в первый день 15 мин, во второй - 10 мин;
2) картофель моют мылом со щеткой, промывают в проточной воде, очищают, вновь промывают, отвешивают 1 кг и кипятят 15 мин в 2 л водопроводной воды. После отстаивания отвар сливают, пропускают через ватно-марлевый фильтр, разливают по 110 мл и стерилизуют одновременно с нижеуказанными компонентами 3 и 4 в автоклаве следующим образом: доводят давление до 1 ати, после чего аппарат выключают и, спустив пар, дают остыть в закрытом положении;
3) в 1 л дистиллированной воды растворяют 1 г двузамещенного фосфата калия, 1 г цитрата натрия, 1 г сульфата магния, 5 г пептона и 30 мл глицерина. Стерилизуют так же, как картофельный отвар;
4) 10 г лимонной кислоты растворяют в 90 мл дистиллированной воды. Стерилизуют так же;
5) 2 г малахитовой зелени растворяют в 100 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.
Непосредственно перед составлением среды 10 свежих диетических яиц обрабатывают, как указано в разделе Возбудитель туляремии, и стерильно выливают в колбу содержимое 6 яиц целиком и 4 желтка. Добавляют по 100 мл молока, картофельного отвара и солевого раствора, 7,5 мл краски малахитовой зелени и 5 мл 10%-ной лимонной кислоты. Содержимое колбы. хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 4-5 мл, скашивают и в таком положении свертывают в аппарате для свертывания сывороток при 850С 2 дня по 30 мин или однократно при 900С в течение 1 ч. При отсутствии конденсата в пробирки асептически вливают по 0,5 мл солевого раствора (см. выше) и парафинируют пробки. Хранят при 2-60С не более 14 дней.
Жидкая полусинтетическая среда. Состав: одноосновной фосфат калия (КН2РО4) - 1,5 г, двуосновной фосфат натрия (NazHPO.· 2HzO) - 2,5 г, сульфат магния (MgS04·7H20) -0,5 г, цитрат натрия-l,5 г, цитрат аммиак-железа - 0,05 г, l-аспарагин - 1 г, глицерин х. ч. - 30 мл, дистиллированная вода до 1 л.
В колбе на 1 л подогревают на водяной бане (700С) 500 мл дистиллированной воды и растворяют в ней поочередно указанные компоненты. Объем раствора доводят до 1 л, пропускают через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2 и разливают в колбы по 50 или 100 мл. Стерилизуют при 1 ати 30 мин. готовую среду можно хранить при 2-60С до 6 месяцев.
Перед посевом среду разливают в пробирки по 2 мл и стерилизуют при 1 ати 20 мин. По охлаждении в каждую пробирку асептически добавляют по 0,2 мл нативной бычьей сыворотки - и по 0,3 мл раствора пенициллина, содержащего 100-150 ЕД/мл. Концентрация пенициллина 12-18 ЕД/мл среды.
Кровяная среда Школьниковой. В колбу с 10 мл 5%-ного стерильного водного раствора цитрата натрия берут асептическн 50 мл крови барана и перемешивают. Кровь стерильно переливают в колбу со 150 мл дистиллированной воды и вновь перемешивают. После гемолиза эритроцитов лаковую кровь разливают в пробирки по 5 мл (лучше по 2-3 мл). При соблюдении стерильности среду можно хранить на холоду до 7 дней.
«Новая» среда по Мордовскому.» Состоит из равных объемов желточной массы куриных яиц и питательного раствора.
Приготовление раствора. Однозамещенный фосфат калия 1 г, цитрат натрия 1 г, сульфат магния 1 г, гликокол 4 г, глицерин 70 мл в указанной последовательности растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды, доводят ею объем раствора до 1 л и перемешивают. Раствор в объемах 100 или 200 мл разливают в стерильные флаконы и автоклавируют, доводя давление до 1,5 ати, после чего сразу же выключают автоклав и спускают пар. Хранят при 2-60С до 4 месяцев.
Приготовление желточной массы. Свежие диетические яйца обрабатывают, и желтки собирают, как описано в разделе Возбудитель туляремии. Измеряют объем желтков, вносят их в колбу с бусами и встряхивают. На каждые 100 мл массы добавляют по 3,5 мл 2%-ного стерильного водного раствора малахитовой зелени и перемешивают.
К желточной, массе добавляют равный объем питательного раствора, тщательно перемешивают и разливают в пробирки по 4-5 мл с помощью большой стерильной воронки, па которую надета резиновая трубка со стеклянным наконечником и зажимом. Среду свертывают в скошенном положении при 850С в течение 50 мин. После свертывания на дне пробирки должен собраться конденсат; если его нет, в пробирки добавляют по 5-6 капель питательного раствора.
До употребления среду можно хранить не более 3 недель. В плотно завернутых и обвязанных целлофановых пакетах Прi1 содержании в холодильнике среда годна к использованию до 3 месяцев.
Среды с туберкулостатиками. Плотные среды готовят на основе одной из сред: Петраньяни, Гельберга или Левенштейна - Йенсена. Перед свертыванием среду разливают по 50 мл в стерильные колбы с бусами. Число колб должно соответствовать общему числу разведенный испытуемых туберкулостатических препаратов. В каждую колбу вливают определенный раствор препарата и тщательно перемешивают. Затем среду разливают в пробирки по 5 мл и свертывают в скошенном положении при 850С в течение 1 ч.
Туберкулостатические препараты за несколько часов до приготовления среды разводят стерильной дистиллированной водой по следующей схеме, составленной из примерного расчета на 10 испытуемых культур.