Культивирование вирусов, патогенных для человека и животных

Многие вирусы, патогенные для человека и животных, хорошо культивируются в развивающемся курином эмб­рионе. К ним относятся вирусы вакцины, бешенства, свинки, кори, герпеса и ряд других. Для инокуляции вируса чаще всего используется обо­лочка, желточный мешок и неко­торые другие части эмбриона.

Инокуляции подвергаются оплодотворенные яйца, прошедшие инкубирование при 38° С в течение 3—13 дней. Подходящий возраст эмбриона определяется в зависимо­сти от особенностей данного вируса, а также от того, какой орган избирается для инокуляции. Для нанесения вирусного материала на оболочку она обнажается путем удаления небольшого участка скорлупы и разрыва скорлуповой оболочки. Нужное для операции место определяется при просвечивании яйца. Вскрытый участок скорлупы после заражения закрывает­ся покровным стеклом, края которого заливаются пара­фином.

После инокуляции яйца инкубируются при 36° С, и в них размножается вирус.

Для накопления вирусов широко применяются также культуры нормальных и опухолевых тканей. Наиболее распространен способ однослойной культуры тканей на стекле. Питательная среда содержит плазму или сыво­ротку крови, к которым в некоторых случаях прибавляют экстракт куриного эмбриона. Добавляется также сбалан­сированный солевой раствор.

Размножение фитопатогенных вирусов. Проникнув в результате инокуляции в клетки расте­ния-хозяина, фитопатогенные вирусы размножаются, пре­терпевая при этом цикл развития, включающий каче­ственно различные стадии, или фазы. Весь цикл развития вирусов пока не исследован. Наиболее изучен в этом отно­шении вирус табачной мозаики.

В развитии этого вируса отчетливо выделяются две фазы, хотя в действительности их, возможно, больше: вегетативная фаза и фаза покоя.

Вегетативная фаза, во время которой вирус размно­жается, наступает через 1—2 ч после заражения воспри­имчивого хозяина в условиях оптимальной температуры (Сухов и Капица, 1956). Размножаясь вначале в отдель­ных клетках, вегетативный вирус по плазмодесмам про­никает в смежные клетки, где также размножается. Попав в ту или иную клетку, вегетативный вирус размно­жается в ней не беспредельно, а ограниченное время, длящееся приблизительно 9—10 ч. Только после этого в данной клетке вирус переходит из фазы размножения в фазу покоя.

Переход в фазу покоя обусловлен исчерпыванием субстратов, необходимых для размножения вируса, или же накоплением продуктов обмена, тор­мозящих его дальнейшее размножение.

Вегетативный вирус по ряду свойств отличается от по­коящегося. Характерным отличием является его неспо­собность заражать новые растения при использовании обычных методов инокуляции. Вегетативный вирус прак-тически лишен контагиозности, что объясняется быстрой его инактивацией при разрушении тканей в момент при­готовления инокулюма.

Установлено, что при выдерживании листьев с накоп­ленным в них вегетативным вирусом в течение 2—3 ч при 28° С в них появляется значительное количество инфекционного вируса.

Течение инфекционного процесса в клетке сопровож­дается определенными изменениями в ее органоидах. По данным Виттштейна и Цеха (1962), первая фаза репродукции ВТМ характеризуется усилением синтеза нуклеи­новых кислот в ядре и увеличением размеров последнего. Эти изменения становятся заметными уже через 30 мин после заражения и прогрессируют в течение следую­щих 2—3 ч.

Ядро при этом пронизывается системой цитоплазматических каналов, окаймленных ядерной мембраной. В каналах находятся митохондрии, мембраны Гольджи или эндоплазматического ретикулума. Через 3—7 ч после заражения в цитоплазме, окаймляющей ядро, появляется материал, абсорбирующий ультрафиолетовые лучи в об­ласти волн, поглощаемых нуклеиновыми кислотами. К кон­цу этого периода содержание нуклеиновых кислот в ядре падает и абсорбирующий материал из области, окружаю­щей ядро, рассеивается в цитоплазме. Масса цитоплазмы при этом увеличивается. В ней интенсивно накапливаются митохондрии, элементы Гольджи, эндоплазматический ретикулум и другие цитоплазматические органоиды.

Начиная с 9-го ч после заражения, в цитоплазме накапливается вирусный белок, участвующий в образова­нии спирализованных вирионов ВТМ, и к 25-му ч форми­руются новые кристаллические включения вируса.

Размножение бактериофагов. Процесс заражения бактерио-фагом бактериальной клет­ки начинается с адсорбции вирионов бактериофага на ее оболочке.

Бактериофаги на бактериальных клетках адсорби­руются при всех градациях температуры от 0 до 37° С. Однако бактериофаг при низкой температуре исторгает генеративный материал не в клетку, а в окружающую среду и заражения бактерии не происходит.

Инъекция ДНК бактериофага в бактериальную клетку происходит замедленно при 37° С и сильно ускоряется при 44° С, что связано с уменьшением вязкости нуклеиновой системы.

При гидро­лизе участка бактериальной оболочки, вызываемом фер­ментом прикрепившегося бактериофага, появляются веще­ства со свободными аминогруппами. Предполагается, что эти вещества вызывают исторжение ДНК (Гарен и Коз­лов, 1959).

Бактериофаги, имеющие спермиеобразную форму, адсорбируются на бактериальной оболочке концом хвостовидного придатка. В результате действия ферментной системы, заклю­ченной в хвостовидном отростке, целостность оболочки нарушается, образуется отверстие, через которое в цито­плазму клетки исторгается внутреннее содержимое кор­пускулы, состоящее у бактериофага из ДНК, белка и аргининсодержащего вещества. Основную массу гене­ративной системы составляет нуклеиновая кислота.

После внедрения генеративного материала в цитоплаз­му бактерии наступает латентный период инфекции, в течение которого бактериофаг находится в состоянии размножения. Разные формы бактериофага имеют раз­личную продолжительность латентного периода.

В вегетативной фазе развития бактериофаг не обладает приспособлениями, необходимыми для внедрения в новые бактериальные клетки, и поэтому неинфекционен. Если механически разрушить бактериальные клетки, несущие вегетативный бактериофаг, и внести этот материал в куль­туру восприимчивых бактерий, лизиса не наступает. неспособен заражать новые бактериальные клетки.

После проникновения генеративной системы бактерио­фага в клетку начавшийся инфекционный процесс прояв­ляется прежде всего в разрушении нуклеоидов бактерии. В это же время начинается синтез ДНК бактериофага. В различных участках клетки образуются вакуоли, заполняющиеся тонким фибриллярным материалом, состоя­щим из рыхло расположенных нитей вирусной ДНК. Эти области имеют непра­вильные очертания, но они ограничены и фибриллы не сме­шиваются с рибосомами цитоплазмы.

В местах скопления фибрилл образуются плотные тельца, по величине близкие к головке бактериофага, но лишенные белковой оболочки. Их образование связано с конденсацией индивидуальных цепей ДНК. В это время в участках скопления указанных частиц сосредоточены значитель­ные массы белковых субъединиц. В краткий период вре­мени, длящийся около 1 мин, происходит формирование белковой оболочки, окружающей каждое нуклеиновое тельце. В следующие 5 мин завершается созревание частиц бактериофага, и они приобретают свой характер­ный вид.

Размножение зоопатогенных вирусов. Довольно хорошо изучен процесс репродукции малых, содержащих РНК энтеровирусов, к которым относятся вирусы полиомиелита, Коксаки и др.

Первый этап инфекции вируса полиомиелита связан с адсорбцией вирионов на поверхности восприимчивых клеток. Адсорбция специфична и происходит только на клетках тканей приматов и человека. На клетках других млекопитающих вирионы этого вируса не адсор­бируются. Вызывающий адсорбцию рецептор в оболочках клеток приматов представлен специфическими липопротеидами. Специфичность адсорбции обусловлена свой­ствами белковой оболочки вириона. Инфекционная РНК вируса, выделенная из вирионов, лишена этой специфич­ности и может вызвать заражение клеток в культуре тка­ней млекопитающих, относящихся к разным отрядам. Однако после прохождения одного цикла развития вновь образовавшиеся вирионы неспособны возобновить инфек­ционный процесс в культурах тканей этих животных.

После адсорбции вирионов на плазматических мембра­нах клеток в культуре тканей происходит нарушение целостности капсиды с освобождением вирусной РНК. Этот материал проникает внутрь клетки посредством пиноцитоза, т. е. вовлечения частиц внутрь цитоплазмы в результате образования глубоких впячиваний мембраны, преобразующихся затем в мелкие вакуоли.

Латентный период инфекции вируса полиомиелита длится 2,5—3 ч. В это время в клетках протекают следую­щие процессы. РНК вируса связывается с рибосомами и при посредстве их аппарата индуцирует синтез специ­фической вирусной репликазы. Последняя, взаимодей­ствуя с вирусной РНК, катализирует синтез новых цепей РНК. Несколько позже, используя рибосомы, вирусная РНК индуцирует синтез белков, необходимых для обра­зования оболочки вирионов.

Процесс объединения цепей РНК и белковых субъеди­ниц в структуру вирионов происходит в конце латентного периода и определяется, вероятно, физической комплементарностью этих компонентов.

Таким образом, рибосомы являются теми органоидами клетки, где вирусная РНК осуществляет паразитическую функцию и организует синтез вирусных белков.

Латентные вирусные инфекции. Латентное носительство вирусов, когда их присутствие в организме хозяина не проявляется никакими внешними симптомами, широко распространено в природе.

Например, у картофеля обнаружен вирус S, выявляе­мый серологически и при посредстве электронного микро­скопа, но не вызывающий заметных симптомов. К латент­ным вирусам относится также «маскированный» штамм вируса табачной мозаики, выделенный Холмсом (1934) в опытах по температурной изменчивости вируса. Расте­ния табака, зараженные этим штаммом, выглядят как здоровые, но в их тканях постепенно накапливается высокая концентрация вируса.

Среди вирусов, патогенных для животных, также известны латентные формы. Например, вирус подчелю­стных желез морской свинки часто присутствует у внеш­не здоровых животных. В клетках желез он образует харак­терные внутриядерные включения. При подкожном зара­жении свинок материалом из инфицированных желез не возникает никаких внешних симптомов, но в ядрах подчелюстных желез вскоре появляются включения. Только при интрацеребральном введении такого материала молодым животным возникает тяжелое поражение, и через 5—7 дней они погибают.

Латентная инфекция наблюдается также при распро­странении простого герпеса. Вирус герпеса присутствует у очень большого числа людей, изредка проявляясь в виде «лихорадки» или мокнущих пузырьков в области губ и ротовой полости. Заражение вирусом происходит в раннем детстве, когда он вызывает незначительные симп­томы афтического стоматита. После выздоровления вирус остается в организме неопределенно долгое время, нахо­дясь в латентном состоянии. При действии некоторых провоцирующих внешних факторов латентное состояние нарушается, и возникают герпетические поражения.

Явление латентной инфекции характеризуется наибо­лее уравновешенными отношениями между хозяином и паразитом и обеспечивает для последнего наилучшие условия для выживания и распространения в природе. Еще более совершенную форму взаимоотношений пред­ставляет симбиоз, когда организм хозяина получает какие-либо преимущества от поселившегося в нем симбион­та. В случае фито- и зоопатогенных вирусов положитель­ное значение для хозяина может иметь бессимптомное носительство непатогенных штаммов, обеспечивающее ин­фекционный иммунитет против высоковирулентных штам­мов. Такое же значение имеет лизогенность бактерий, сопряженная с иммунитетом против лизирующего бакте­риофага.

ВЛИЯНИЕ АНТРОПОГЕННЫХ

ФАКТОРОВ НА МИКРОБНОЕ

СООБЩЕСТВО ПОЧВЫ