Описание лабораторных работ, выполняемых на занятии

Работа 1. Зависимость скорости реакции от температуры.

Принцип метода. Метод основан на определении скорости гидролиза α-амилазой слюны крахмала в зависимости от температуры.

Ход работы. В пробирку помещают 5 капель слюны, кипятят 1-2 мин на водяной бане и остужают. В две другие помещают по 5 капель некипяченой слюны.

Вносят во все пробы по 10 капель раствора крахмала и ставят первую и вторую пробирки в водяную баню при 38°С на 10 минут, а третью – в воду со льдом или снегом на 10 мин. Затем прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора йода в иодиде калия и сравнивают развивающуюся окраску.

Оформление работы. Данные оформляют в виде таблицы, делают вывод о зависимости ферментативной реакции от температуры и причинах этой зависимости.

Фермент	Субстрат	Окрашивание с йодом	Температура

Вывод:

Работа 2. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды.

Принцип метода. Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала, определяемого пробой с йодом, под действием α-амилазы слюны при разных значениях рН среды. В результате устанавливается оптимум рН действия α-амилазы.

Ход работы. В пять пробирок отмеривают по 10 капель растворов фосфатно-цитратного буфера со следующими значениями рН: 5,6; 6,4; 6,8; 7,2; 8,0. Прибавляют во все пробы по 5 капель разведенной в 10 раз слюны и по 10 капель раствора крахмала и ставят пробирки в водяную баню при 38°С. Через 1-2 мин отбирают по 1 капле содержимого в другие пробирки и приливают по 1 капле раствора йода в иодиде калия. Отмечают время наступления красного окрашивания (стадия образования эритродекстринов) в каждой из пяти проб.

Оформление работы. Данные оформить графически, откладывая по оси абсцисс значения рН среды и по оси ординат – время (в мин), которое необходимо для гидролиза крахмала до стадии эритродекстринов. Сделать вывод об оптимуме рН действия α-амилазы слюны.

Вывод:

Практическое значение работ 1 и 2. Кинетические свойства ферментов изучаются для подбора оптимальных условий (концентрация субстрата, оптимум рН среды и температуры, ионный состав среды), определения активности ферментов в научных и клинических исследованиях, а также при стандартизации ферментных препаратов. Неверно подобранные стандартные условия определения конкретного фермента приводят к ошибкам в диагностике заболеваний и контроле качества ферментных препаратов.

Работа 3. Специфичность действия амилазы и сахаразы.

Принцип метода. Метод основан на сравнительном изучении гидролиза α-амилазой и сахаразой разных субстратов, содержащих гликозидные связи: крахмала и сахарозы. Гидролиз крахмала и сахарозы оценивают пробой Феллинга на восстанавливающие сахара (мальтоза, глюкоза).

Ферменты катализируют реакции по схеме:

_{α-амилаза}

Крахмал + n Н₂О декстрины + Мальтоза

_{сахараза}

Сахароза + Н₂О Глюкоза + Фруктоза

Ход работы. В одну пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в другую – такой же объём раствора сахарозы. Для выявления специфичности α-амилазы в обе пробы добавляют по 5 капель разбавленной слюны, перемешивают встряхиванием и ставят в водяную баню при 38°С на 10 мин. Затем с жидкостью в обеих пробирках проделывают пробу с реактивом Феллинга (к 3 мл из каждой пробирки добавляют по 1 мл реактива Феллинга и нагревают верхний слой смеси до кипения). Отмечают появление в одной из проб красного осадка оксида меди (I).

Для выявления специфичности сахаразы в одну пробирку наливают 10 капель раствора крахмала, а в другую –сахарозы и прибавляют к ним по 5 капель экстракта сахаразы дрожжей. Пробы перемешивают встряхиванием и помещают в водяную баню при38°С на 10 мин, после чего с жидкостью обеих пробирок проделывают пробу с реактивом Феллинга.

Оформление работы. Данные занести в таблицу, сделать вывод о специфичности изученных ферментов и обозначить, к какому типу специфичности они относятся.

Фермент	Субстрат	Проба с реактивом Феллинга	Специфичность действия

Вывод:

Практическое значение работы. Ферменты с абсолютной и относительной групповой субстратной специфичностью, обладающие меньшей избирательностью действия на субстраты, участвуют, как правило, в гидролизе питательных веществ или превращении чужеродных соединений. В частности, α-амилаза и сахараза проявляют специфичность не к структуре субстрата в целом, а к типу связей, находящихся в соответствующих углеводах.