Фотоколориметрическим микрометодом Енике

Ц е л ь р а б о т ы – определить содержание общего азота в мышечной ткани фотоколориметрическим методом Енике.

Фотоколориметрический метод Енике включает:

- сжигание биологического материала;

- реакцию Бертло - образование индофеноловой сини при взаимодействии

- NH₃ в щелочной среде с фенольным реактивом;

- Фотоколориметрирование комплексов при длине волны 570 нм, рабочей длине кюветы 1 см.

Оборудование, реактивы:

Фотоэлектроколориметр; кюветы; бани песчаные; пробирки; реактив фенольный; раствор гипохлорита натрия щелочной (0,02 М NaOCl в 2,5 н растворе NaOH); HCl_4.

Приготовление фенольного реактива: к 2 мл 85%-го раствора фенола прибавляют 5 мл 0,2%-го раствора нитропруссида натрия, 73 мл воды - получают 90 мл фенольного реактива. Реактив хранят в темной склянке в течение нескольких недель.

Приготовление щелочного раствора гипохлорита натрия: готовят 2,5 н раствор гидроксида натрия. Для этого 10 г NaOH помещают в мерную колбу на 100 мл, растворяют в небольшом количестве воды, перемешивают, доводят водой до метки, переносят в коническую колбу. Для получения 0,02 М

NaOCl в 2,5 н растворе NaOH берут 0,143 г NaOCl и помещают в коническую колбу с раствором NaOH.

Порядок выполнения работы:

1. Минерализация биологического материала.

Биологический материал, содержащий 10-20 мг белка, подвергают сжиганию в присутствии хлорной кислоты HClO₄. Помещают 0,1 г мышечной ткани в термостойкую пробирку, добавляют 0,06 мл 57%-го или 0,1 мл 5 н раствора HClO₄.

Минерализацию проводят с помощью песчаной бани при температуре 205…215 ⁰С в течение 20 мин. Пробирки охлаждают при комнатной температуре.

2. Проведение реакции Бертло.

В охлажденную пробирку добавляют 1 мл воды, 1 мл фенольного реактива, 0,4 мл щелочного раствора NaClO. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин.

3. Фотоколориметрирование.

Фотоколориметрирование проводят при длине волны 570 нм,

рабочей длине кюветы 1 см.

Построение калибровочного графика.

В шесть пробирок вносят стандартный раствор (NH₄)₂SO₄ (0,1 моль/л), содержащий от 0,02 до 0,2 мкмоль/мл азота, доводят водой до 1 мл, добавляют по 1 мл фенольного реактива, по 0,4 мл щелочного раствора (NH₄)₂SO₄ (табл. 10). Фотоколориметрируют все пробы при длине волны 570 нм, рабочей длине кюветы 1 см.

Таблица 10

Номер пробы	n(NH4)2SO4, мл	C(N), мкмоль/мл
		0,2
	0,8	0,16
	0,6	0,12
	0,5	0,10
	0,2	0,04
	0,1	0,02

Вопросы для самоконтроля:

1. Каковы биологические функции белков?

2. Дайте классификацию белков.

3. Какие типы структурной организации характерны для белков? Перечислите связи, характерные для каждой структуры.

4. Объясните метод химического скора. Что такое лимитирующие аминокислоты?

5. Какие аминокислоты относятся к незаменимым аминокислотам? Перечислите незаменимые аминокислоты.

6. Дайте определение биологически полноценных и биологически неполноценных белков. Приведите примеры.

7. Охарактеризуйте белки мышечной ткани рыбы. Как фракционируют данные белки?

8. Какие цветные реакции на белки являются универсальными? Какие реакции относятся к специфическим?

9. Какая реакция используется для идентификации серосодержащих аминокислот?

10. Какая цветная реакция позволяет определить полноту гидролиза белков?

11. Какие реакции являются качественными реакциями на циклические аминокислоты?

12. Какие фотоколориметрические методы используются для количественного определения водорастворимого белка? Охарактеризуйте биуретовый макро- и микрометоды, метод Лоури.

13. Объясните основные этапы метода Къельдаля.

14. Что такое высаливание белков? Охарактеризуйте высаливающие факторы.

15. Объясните процесс денатурации белков. Что такое ренатурация?

16. Перечислите денатурирующие факторы (физические и химические).

17. Охарактеризуйте изоэлектрическое состояние белков. Что такое изоэлектрическая точка?

18. Приведите примеры белков соединительной ткани.

19. Как классифицируются рыбы по содержанию белка?

20. Каковы нормы потребления белка?

21. Приведите формулы сбалансированного питания для белков.

РАЗДЕЛ П. ФЕРМЕНТЫ.