Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также изучения их химического состава и структуры непременным условием является их выделение в химически чистом, гомогенном состоянии. Последовательность операций при этом следующая:
1. измельчение биологического материала (гомогенизация),
2. извлечение протеинов (перевод их в растворенное состояние- экстракция),
3. выделение исследуемого белка из смеси других (очистка и получение индивидуального белка).
Все методы разделения смесей основаны на том, что их компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Очищение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей.
Остановимся на наиболее распространённых методах.
1. Ультрацентрифугирование. В его основе лежат различия в молекулярных массах протеинов. В кювету помещают раствор буфера и сверху наносят тонкий слой смеси белков. Сосуд помещают в ультрацентрифугу, при вращении ротора которой создаётся центробежное ускорение, пропорциональное молекулярной массе протеинов. В результате последние оседают в растворе буфера. Причём выпавший осадок расслаивается на отдельные фракции, имеющие разную молекулярную массу (Мr). Их можно легко извлечь. Но этот способ требует много времени и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны более простые методы (гель-хроматография и электрофорез).
|
|
2. Гель-фильтрация (гель-фильтрационная хроматография). Метод основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярными массами, по-разному распределяются между подвижной и неподвижной фазами. Хроматографическая колонка (рис. 7) заполняется пористым гелем полисахарида (сефадекса, сефактила, агарозы и др.), представленным в виде гранул с порами. Их размер можно выбирать в зависимости от целей исследования. Внутри гранул находится жидкость, в которую могут проникать низкомолекулярные соединения и белки с небольшой Мr (молекулярной массой). На хроматографическую колонку наносят изучаемую смесь и с помощью подвижной фазы растворителя, вымывают большие мицеллы (белков), а малые, проникая внутрь гранул, задерживаются на некоторое время. Используя диаметр пор оценивают размеры молекул. Легко рассчитать молекулярную массу исследуемого белка, зная объем растворителя.
3. Электрофорез использует способность протеинов двигаться в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду и обратно пропорциональной их массам. Белки с отрицательным зарядом перемещаются к аноду (+), а с положительным – к катоду (-). Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном или полиакриламидном (ПААГ) гелях и т.д. Для обнаружения локализации полимеров носители обрабатывают красителем (бромфеноловым синим или амидовым чёрным), что позволяет обнаружить пятна окрашенных белков.
|
|
4. Диализ применяют для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих больших размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как вода и низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором (рис. 8). В лаборатории подлежащую диализу смесь помещают в мешок из целлофана и погружают последний в буферный раствор. Непрерывный ток воды через сосуд приводит к полному выходу содержащихся в целлофане низкомолекулярных веществ, а белки остаются внутри.