Унифицированный метод определения креатина по цветной

Реакции Яффе

В синтезе эндогенного креатина принимают участие аминокислоты – аргинин, глицин, метионин. Креатин при фосфорилировании превращается в креатинфосфат, из которого образуется креатинин (ангидрид креатина). Этот процесс в живом организме необратимый.

Креатин и креатининфосфат являются важными азотистыми веществами мышц, участвующими в химических процессах, связанных с мышечными сокращениями. В сыворотке крови содержится в основном креатинин. Суточное выделение креатинина для каждого человека – величина постоянная, которая зависит от массы мышечной ткани и мало зависит в отличие от мочевины от питания. Содержание креатинина в сыворотке крови уменьшается с возрастом.

Принцип метода: Креатинин реагирует с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием окрашенных соединений.

Реактивы:

1. Пикриновая кислота, насышенный раствор. В 100 мл воды растворяют 2 г пикриновой кислоты при нагревании в горячей бане. Затем профильтровать.

2. НСI

3. Основной калибровочный раствор креатинина, 10 ммоль/л: 113,1 мг креатинина доводят до 100 мл 0,1 моль/л раствором НCI. Для определения креатинина в сыворотке крови рабочий калибровочный раствор получают разведением основного раствора водой в 100 раз; 1 мл раствора содержит 0,1 ммоль креатинина.

4. Натр едкий, 2,5 моль/л.

Ход определения: 2 мл сыворотки крови смешивают с 6 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 минут пробирку помещают на 15-20 сек в кипящую водяную баню, затем центрифугируют. К 4 мл центрифугата добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра и тщательно смешивают. Иногда после подщелачивания раствор мутнеет вследствие выпадения фосфатов. В этом случае раствор еще раз центрифугируют. Затем раствор доводят до объема 10 мл водой. Через 10 мин измеряют в кювете с толщиной слоя 2 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба: 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра доводят до объема 10 мл водой.

Расчет производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: В пять пробирок добавляют последовательно: 0,4 мл; 0,8 мл; 1,6 мл; 2,4 мл; 3,2 мл рабочего калибровочного раствора креатинина. В них добавляют по 3,0 мл пикриновой кислоты и по 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра, доводят объем до 10 мл. Через 10 мин проводят измерения при тех же условиях, что и опытные пробы. Концентрация креатинина в пробах составляет с первой по пятую соответственно: 40 ммоль/л; 80 ммоль/л; 160 ммоль/л; 240 ммоль/л; 320 ммоль/л.