Уреазный метод определения мочевины по салицилатно-гипохлоритной реакции

Принцип метода: Мочевина под действием уреазы разлагается с образованием аммиака и углекислого газа. Выделившийся аммиак образует с гипохлоритом натрия и салицилатом натрия окрашенный продукт. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию мочевины.

Реактивы:

1. Этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль ЭДТА.

2. Азид натрия.

3. Натр едкий, 5 моль/л.

4. Гипохлорит натрия.

5. Йодит калия, 50 г/л.

6. НСI, 6 моль/л.

7. Нитропруссид натрия, 2,69 ммоль/л.

8. Буферный раствор: ЭДТА – 26,9 ммоль/л; НСI – 20 ммоль/л; азид натрия – 15,4 ммоль /л, рН 6,5, 10 г ЭДТА, 1 г азида натрия растворяют в 800 мл воды с 20 мл 1 моль/л раствора едкого натра. Доводят рН 6,5 и доливают водой до 1 л.

9. Салицилат натрия, 1060 ммоль/л: 170 г салицилата натрия растворяют в воде и доводят объем до 1 л.

10. Гипохлорит натрия, раствор: 70 ммоль/л гипохлорита натрия и 2500 ммоль/л натра едкого. Масса сначала густеет, а затем разжижается. Надосадочную жидкость сливают и фильтруют через промытый водный фильтр. Как только раствор приобретает слабо желтую окраску, добавляют 10 капель 1%-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания.

11. Уреазный реактив: 200 мг препарата уреазы растворяют в 1 л буферного раствора, хорошо перемешивают, профильтровывают.

12. Салицилатный реактив – 1060 ммоль/л салицилата натрия и 2,69 ммоль/л нитропруссида натрия: 800 мг нитропруссида натрия растворяют в 1 л раствора салицилата натрия, фильтруют.

Ход определения: Реакцию проводят при 37 °С. Опытная проба: к 10 мкл сыворотки добавляют 0,1 мл воды или 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, 0,5 мл уреазного реактива. Смесь инкубируют в течение 3 мин при температуре 37 °С, затем добавляют 2 мл салицилатного реактива, перемешивают. Добавляют 2 мл гипохлоритного реактива. Через 5-6 мин инкубации при 37 °С, измеряют оптическую плотность раствора на ФЭК в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы на реактивы. Холостую пробу на сыворотку ставят так же, как опытную, но уреазный реактив добавляют после салицилатного реактива перед гипохлоритом. Измеряют против холостой пробы на реактивы.

Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют в тех же условиях, что и опытную, против холостой пробы на реактивы.

Расчет производят по следующей формуле:

Концентрация мочевины, ммоль/ л = С_к х (Е_оп - Е_{хол.сыв.})/Е_к

Где Е_оп – экстинкция опытной пробы, измеренная против холостой пробы на реактивы; Е_{хол.сыв.} - экстинкция холостой пробы на сыворотку, измеренная против холостой пробы на реактивы. С_к – концентрация мочеины в калибровочном растворе, ммоль/л.

Нормальные величины. Сыворотка крови – 2, 5-8,3 ммоль/л, или 20-50 мг/100мл.