Как можно обнаружить оксид азота в клетке

Взаимодействие NO с супероксидом существенно снижает его уровень в клетках и тканях, что затрудняет количественные измерения NO. Для улавливания NO нашей группой было предложено использовать специ­альные ловушки — комплексы двухвалентного железа с производными тиокарбоновой кислоты — дитиокарбамата (R₂NCS2, где группа R, например, представляет собой С₂Н₅). Эти комплексы связывают молекулу NO и образуют относительно стабильные парамагнитные комплексы с железом, которые можно зарегистриро­вать методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). По интенсивности сигнала ЭПР (рис. 2) можно судить о количестве продуцируемого NO (подробнее о методе ЭПР и его биологических применениях см. [4]).

Предложенный нами метод детектирования оксида азота $ настоящее время широко используется в различ­ных лабораториях мира. Так был обнаружен оксид азота в изолированных тканях и клетках и непосредственно в тканях животных (мышей и крыс). Этим методом уда­лось показать, что именно L-аргинин является единст­венным субстратом NOS, продуцирующим N0 в клет­ках и тканях, что именно молекулы N0, а не какие-либо нитрозосоединения или ионизованные формы N0 (например, N0") являются продуктами реакции, катализируемой NOS. Наконец, было показано, что в образующийся из L-аргинина оксид азота включается атом кислорода, поступающий не из воды, а из молеку­лы кислорода.

Рис. 2. Спектры ЭПР мононитрозилыных комплек­сов железа с дитиокарбаматом в активированных макрофагах, продуцирующих N0. Вверху - спектры ЭПР макрофагов без активации у них синтеза N0. Внизу - спектры ЭПР макрофагов после активации в них синтеза N0 в присутствии L-аргинина. В этом слу­чае наблюдается интенсивный сигнал ЭПР, который свидетельствует о присутствии в системе N0. Три характерные компоненты спектра ЭПР, называемые триплетом, обусловлены взаимодействием неспаренного электрона с ядром азота (см. подробнее [4])

В последние годы заметное развитие получила тех­ника ЭПР-томографии, позволяющая изучать прост­ранственное распределение N0-синтезирующих сис­тем по органам и внутри органов. Этим достижениям мы обязаны группам американских исследователей во главе с Д. Звайером и японских исследователей во главе с Т. Йошимурой. Метод ЭПР-томографии позволил наблюдать за распределением N0 по отделам мозга жи­вотных и в функционирующем изолированном сердце. Разрабатываются подходы, которые позволят делать такой же анализ и на более крупных биообъектах, воз­можно на человеке.

В настоящее время используются и другие методы выявления N0 в биосистемах:

а) хемилюминесцентный метод;

б) изотопный метод, в котором прослежи­вается превращение аргинина в цитрулин;

в) метгемоглобиновый метод, в котором изучается превращение оксигемоглобина в метгемоглобин под действием N0;

г) электродный метод, позволяющий оценивать уро­вень N0 по его взаимодействию с избирательным для него электродом. Все эти методы более чувствительны по сравнению с ЭПР-спектроскопией, однако высокая избирательность в отношении именно N0 характерна только для метода ЭПР.